莊惠明 陳大舟 吳 雪 湯 樺

(1.云南省計量測試技術(shù)研究院，昆明 650228；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

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濃縮蘋果汁中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制*

莊惠明1陳大舟2吳 雪2湯 樺2

(1.云南省計量測試技術(shù)研究院，昆明 650228；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

為了滿足國內(nèi)外實驗室對于果汁類產(chǎn)品中農(nóng)藥基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求，研制了濃縮蘋果汁中10擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。選擇濃縮蘋果清汁作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料，采用添加的方式進行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備。通過對10種擬除蟲菊酯在濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的均勻性檢驗和22個月穩(wěn)定性監(jiān)測，結(jié)果表明此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性均達到國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)規(guī)范的要求。采用GC-ECD內(nèi)標(biāo)法和GC-IDMS對10種擬除蟲菊酯農(nóng)藥定值。通過對影響定值結(jié)果的不確定度進行評估和計算，10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的特性量值范圍在0.98～1.16μg/g，不確定度范圍在7.5%～10.3%。

濃縮蘋果汁；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；擬除蟲菊酯類農(nóng)藥

0 引言

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥(Pyrethroids)是20世紀(jì)70年代研發(fā)成功的一類仿生殺蟲劑，被廣泛的應(yīng)用在蔬菜、果樹害蟲防治等方面[1]。我國是世界第一大蘋果生產(chǎn)國，種植面積和產(chǎn)量分別占全球40.6%和42.2%，均居世界首位。我國濃縮蘋果汁貿(mào)易占世界貿(mào)易總額的50%以上,在國際市場占絕對主導(dǎo)份額。然而由于發(fā)達國家近年來對我國濃縮蘋果汁采取的技術(shù)性貿(mào)易壁壘限制逐年嚴(yán)格[2]，準(zhǔn)確檢測濃縮蘋果汁中的農(nóng)藥殘留已成為保證我國濃縮蘋果汁出口的關(guān)鍵。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)越來越廣泛地應(yīng)用在檢測量值溯源、方法開發(fā)、檢測過程中的質(zhì)量控制、檢測方法驗證和實驗室能力考查等多方面[3]。其中食品中農(nóng)藥類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是目前需求最為急迫的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本研究選擇10種常用的擬除蟲菊酯農(nóng)藥[4-5]，采用空白樣品添加的方法，制備了濃縮蘋果汁中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并對此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行定值、均勻性、穩(wěn)定性檢驗和不確定度評估。此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，填補了國內(nèi)外果汁類食品中農(nóng)藥殘留的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)空白，初步滿足了食品檢測實驗室的相關(guān)需求。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的來源

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯菊酯GBW(E)060549、聯(lián)苯菊酯GBW(E)060548、三氟氯氰菊酯GBW(E)061099、氰戊菊酯GBW(E)060072、氯氰菊酯GBW(E)060139、甲氰菊酯GBW(E)060978和溴氰菊酯GBW(E)060138純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由中國計量科學(xué)研究院提供；苯氧菊酯、氟氯氰菊酯和氟胺氰菊酯由德國Dr公司提供。

1.1.2 試劑與材料

溶劑：正己烷，HPLC級和丙酮，農(nóng)殘級(美國Tedia公司)；異辛烷，農(nóng)殘級(Fisher公司)；無水硫酸鈉濃縮蘋果汁樣品(陜西恒星果汁廠)。

材料：VF-1MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；DB-5MS色譜柱30m×250μm×0.25μm，；DB-17色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)。均由Agilent公司提供。

1.2 儀器與方法

1.2.1 儀器

檢測儀器：Agilent 6890-5975氣相色譜質(zhì)譜儀；Agilent 6890氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀配電子捕獲檢測器和火焰熱離子檢測器(GC-ECD&FID)。

前處理儀器：RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；氮氣吹掃儀(美國Organomation公司)；UMX2高精密分析天平，d=0.1μg；XS205 DualRang分析天平，d=0.01mg(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取濃縮蘋果汁樣品4.0g至分液漏斗中，添加相應(yīng)濃度的內(nèi)標(biāo)溶液，加入20mL水搖勻，再加入30mL的丙酮，充分振搖10min，再加入40mL的正己烷，充分振搖10min后，靜置分層，將有機相層通過裝有無水硫酸鈉的漏斗脫水轉(zhuǎn)移至100mL的平底燒瓶中。重復(fù)以上提取步驟，合并有機相提取液到平底燒瓶中。將提取液濃縮至500μL后，轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，準(zhǔn)備進樣。

1.2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件

色譜柱：VF-1MS，30m×250μm×0.25μm；載氣：高純氦氣，流速：1.0mL/min；進樣口溫度：210℃；采用分流進樣，分流比：10:1，進樣量：1μL；傳輸線溫度：250℃；質(zhì)譜離子源：EI，70eV，溫度：230℃。

升溫程序：初始溫度70℃，保留1min，以25℃/min的速度升溫至120℃，再以5℃/min的速度升溫至280℃，保留6min。最終定量提取的離子見表1。

1.2.2.3 氣相色譜-電子捕獲器檢測條件

色譜柱：DB-5MS，30m×250μm×0.25μm；載氣：高純氮氣，流速：1.0mL/min；進樣口溫度：230℃，檢測器：μ-ECD，檢測器溫度：250℃；采用分流進樣，分流比：10:1，進樣量：1μL；升溫程序：初始溫度70℃，保留1min，以25℃/min的速度升溫至180℃，再以4℃/min的速度升溫至260℃，保留17min。

2 濃縮蘋果汁基體樣品的制備

2.1 濃縮蘋果汁基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料的篩選

制備濃縮蘋果汁的原料為陜西某果汁廠生產(chǎn)的無任何添加的濃縮蘋果汁，由完整的275L無菌灌裝包裝中直接采取。采用GC-ECD對濃縮蘋果汁原料進行初測后，未檢出10種擬除蟲菊酯類菊酯類農(nóng)藥。

表1 10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的定性、定量離子及同位素內(nèi)標(biāo)

2.2 制備工具與器皿的滅菌

濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過程所用的玻璃窄口瓶，硅膠管，磁子等器皿均經(jīng)過75%酒精的浸泡滅菌。分裝用的棕色安瓿瓶經(jīng)蒸餾水清洗后，在120℃干燥箱中滅菌4小時。

2.3 濃縮蘋果汁中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的添加與分裝

準(zhǔn)確稱取10.00kg濃縮蘋果汁樣品到窄口玻璃瓶中。將盛有濃縮蘋果汁原料的玻璃瓶通入氮氣進行保護，磁力攪拌瓶內(nèi)的濃縮蘋果汁，逐滴加入配制好的擬除蟲菊酯類儲備液，添加完畢后，繼續(xù)避光攪拌10小時。將濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物熔封于棕色安瓿瓶，10.0mL/瓶，-18℃冰箱冷凍保存。

3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

3.1 定值用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溯源性的確認

10種擬除蟲菊酯純品中，苯氧菊酯、氟氯氰菊酯和氟胺氰菊酯不是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，故而需要對其進行純度的測定，確認其溯源性。分別采用GC-FID[6]和HPLC-DAD[7]方法測定其純度。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)檢驗，計算得出3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的純度和不確定度，合并其余7種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度和不確定度[8]，見表2。

表2 10種定值用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的純度和不確定度

3.2 定值過程

隨機抽取6瓶樣品，分別采用GC-ECD內(nèi)標(biāo)法和氣相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法(GC-IDMS)兩種檢測方法進行測定，每個樣品重復(fù)測定3次并取平均值，結(jié)果見表3。按照“一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)JJG 1006-94”文件[9]中技術(shù)要求，對兩種方法定值數(shù)據(jù)，分別進行格拉布斯(Grubbs)法和夏皮羅-威爾克(Shapiro-Wilk)法的統(tǒng)計學(xué)檢驗，確認定值數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布無離群值后，將兩種檢測方法得到的定值數(shù)據(jù)的平均值作為標(biāo)準(zhǔn)值，得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終定值如表3。

4 均勻性檢驗

隨機抽取15瓶濃縮蘋果汁樣品，每瓶測定3次。采用方差分析法對測定的結(jié)果進行統(tǒng)計檢驗。

表3 濃縮蘋果汁中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的定值數(shù)據(jù)

均勻性檢驗結(jié)果判斷：根據(jù)所取顯著性水平a 和自由度ν1,ν2，從F檢驗臨界值表查得Fa。比較F和Fa，若F>Fa，則認為組內(nèi)和組間無明顯差異，樣品是均勻的。

均勻性的檢測結(jié)果見表4，從中可以看出，臨界值F0.05(14,15)=2.42，10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥均勻性檢驗的F值均小于臨界值，說明該濃縮蘋果汁樣品的均勻性良好。

5 穩(wěn)定性考察

短期穩(wěn)定性主要是考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運輸過程中產(chǎn)生的高溫造成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的變質(zhì)和量值變化。由于濃縮蘋果汁在高溫下，容易發(fā)生變質(zhì)問題，在運輸過程中需采用冷凍運輸保存，故而不考慮此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的短期穩(wěn)定性。

長期穩(wěn)定性是考察標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效使用的時間。濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性考察的時間間隔選擇采用了先密后疏的原則，分別對1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、12個月、18個月和22個月的10種擬除蟲菊酯進行測定。每次測定，隨機抽取3瓶樣品進行。

表4 濃縮蘋果汁中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的均勻性和22個月穩(wěn)定性檢測結(jié)果

6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評估

濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度來源由三個部分組成：樣品定值過程帶來的不確定度、均勻性帶來的不確定度和穩(wěn)定性帶來的不確定度。

6.1 定值不確定度uc

6.1.1 測量過程的不確定度

體現(xiàn)在測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差上。定值數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)檢驗，確定平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差無顯著性差異，將兩組測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值作為測量結(jié)果的不確定度，將兩組數(shù)據(jù)的平方和開方求出標(biāo)準(zhǔn)偏差，記為不確定度ua。

6.1.2 校準(zhǔn)溶液的不確定度

來源于純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和純品不確定度、天平稱量帶來不確定度和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中不確定度。經(jīng)過合成得到不確定度ub。

6.1.3 樣品質(zhì)量的不確定度

來源于稱量過程和操作過程中的由天平和轉(zhuǎn)移過程所帶來的不確定度，估計為0.1%。記為usm，將上述3個分量合成即得到定值合成不確定度uc。

6.2 樣品均勻性引入的不確定度ubb

均勻性研究采用單因素方差分析進行研究，表明樣品均勻性良好。因此，可以用單因素方差分析結(jié)果計算均勻性引入的不確定度，用方差分析法進行計算。s1為均勻性檢驗中組間方差，而s2為均勻性檢驗中的組內(nèi)方差，經(jīng)計算得到，故而物質(zhì)不均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

6.3 樣品穩(wěn)定性引入的不確定度us

對濃縮蘋果汁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行了n=8次穩(wěn)定性檢驗，穩(wěn)定性監(jiān)測的時間間隔為x=22個月。如以x表示穩(wěn)定性監(jiān)測的時間(月)，y表示每次穩(wěn)定性監(jiān)測的檢驗結(jié)果，則存在y=b1x+b。采用趨勢分析法進行穩(wěn)定性評估時，在穩(wěn)定性變化趨勢不明顯的情況下，由穩(wěn)定性引入的不確定度由式us=s(b1)·x計算得到，其中s(b1)為斜率b1的不確定度。

6.4 合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度

通過以上分析，將得到的3個不確定度分量合成即得到溶液合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以擴展因子2得擴展不確定度U，具體值見表5：

表5 濃縮蘋果汁中10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的不確定度

7 結(jié)論

研究了濃縮蘋果汁中的10種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用GC-IDMS和GC-ECD兩種方法定值，并且考察了此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和22個月穩(wěn)定性。結(jié)果證明本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性均良好。對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度進行了評估。已申報并于2012年12月批準(zhǔn)為國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW10084)，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于食品檢測領(lǐng)域果汁樣品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的分析方法的評價、分析過程的質(zhì)量控制、未知樣品的賦值及樣品合格檢驗的判定。

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*國家質(zhì)檢總局食品安全項目( 2012QK360)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.10.03