梁紹燕 湯麗燕 朱允蘭

【摘要】目的 了解JAK2基因V617F突變?cè)诠撬柙錾阅[瘤中的發(fā)生率。方法 收集骨髓增生性腫瘤共26例。其中PV組8例；ET組12例；CML組4例；PMF組2例。直接測(cè)序檢測(cè)JAK2基因V617F突變。結(jié)果 PV組JAK2V617F陽(yáng)性率為87.5%（7/8）；ET組陽(yáng)性率為33.3%（4/12）；PMF組陽(yáng)性率為50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等惡性血液病患者及正常對(duì)照均為陰性。結(jié)論 檢測(cè)JAK2基因V617F突變可作為一種分子標(biāo)記對(duì)PV進(jìn)行診斷，并對(duì)ET、PMF診斷提供幫助。

[Abstract] Objective To learn the incidence of JAK2 gene V617F mutation in the myeloproliferative disease （MPNs）. Methods Collected MPNs 26 cases with PV 8 cases， ET 12 cases and PMF 2 cases， then tested JAK2 gene V617F by sequences. Results The positive rate of JAK2 gene V617F mutation was 87.5% （7/8） in PV and 33.3%（4/12） in ET and 50%（1/2） in PMF. However all the cases in AML、ALL、CML、CNL、CEL were negative. Conclusion JAK2 V617F mutation test might serve as a gene marker for diagnosis in PV， at the same time help to the diagnosis for ET and PMF.

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2015）03-0001-02

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）是一類起源于多能造血干細(xì)胞，以一系或者多系分化相對(duì)較成熟的骨髓細(xì)胞克隆性增生異常為特點(diǎn)的一組疾病的統(tǒng)稱。增生的細(xì)胞其細(xì)胞形態(tài)和功能相對(duì)正常，常表現(xiàn)為多能髓樣造血干細(xì)胞所屬的細(xì)胞系（包括紅細(xì)胞系、血小板系、粒-單核細(xì)胞系）中的一系或多系細(xì)胞惡性增生。骨髓增生性腫瘤（MPNs）包括真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）、慢性髓細(xì)胞樣白血?。–ML）和原發(fā)性骨髓纖維化（IMF）。研究發(fā)現(xiàn)，JAK2 V617F突變發(fā)生在PV、ET、特發(fā)性骨髓纖維化、骨髓發(fā)育不良癥候群、嗜酸細(xì)胞過多綜合征、慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病、慢性中性粒細(xì)胞性白血病、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥等疾病中。正是由于JAK2基因V617F突變?cè)诙喾N疾病中都有發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)人群該基因突變將會(huì)對(duì)進(jìn)一步闡明其引發(fā)的廣譜的血液病提供依據(jù)。

對(duì)于JAK2基因V617F突變進(jìn)行分子診斷國(guó)內(nèi)外的專家建立了數(shù)種方法，包括：直接測(cè)序、特異引物等位基因PCR法、酶切法、熒光PCR法等，本文用測(cè)序法對(duì)MPNs做了檢測(cè)。

1.材料與方法

1.1試劑與儀器：Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司， dNTP，Tag酶購(gòu)自南京凱基，生物工程技術(shù)有限公司，熒光定量PCR儀為羅氏480，凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)UVP公司Imaging System。

1.2標(biāo)本來源：收集重慶市兒童醫(yī)院骨髓增生性腫瘤共26例。其中PV組8例；ET組12例；CML組4例；PMF組2例。

1.3 標(biāo)本采集：采集靜脈全血，EDTA-Na2抗凝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA提?。翰捎么筮B寶生物Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取DNA，操作按說明書進(jìn)行，抽提好的DNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)1.62

1.5 引物設(shè)計(jì)及合成

1.5.1 根據(jù)Genbank提供的參考序列（Accession number：9944145），利用Primer5.0與Bioedit7.0自行設(shè)計(jì)引物探針

1.5.2 引物序列

上游引物：5- AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3

下游引物5-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3

1.6 擴(kuò)增體系及條件

反應(yīng)體系為50ul，包括10×PCR緩沖液10ul；10umol/L dNTP 1ul；5U/ul Taq酶1ul；模板2ul；10pmol/L上、下引物各1ul；ddH2o 34ul。擴(kuò)增條件：95℃ 8分鐘預(yù)變性。然后94℃ 60秒，54℃ 60秒，72℃ 90秒，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10分鐘，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.8.4 測(cè)序，將7.1制備的擴(kuò)增產(chǎn)物

2 測(cè)序結(jié)果

2.1. JAK2V617F突變?cè)趷盒匝杭膊≈械谋磉_(dá)情況

PV組JAK2V617F陽(yáng)性率為87.5%（7/8）；ET組陽(yáng)性率為33.3%（4/12）；PMF組陽(yáng)性率為50%（1/2）；AML、ALL、CML、CNL、CEL等惡性血液病患者及正常對(duì)照均為陰性。JAK2V617F基因突變?cè)赑V、ET、PMF患者中的陽(yáng)性率有顯著性差異（X2=47.799，P<0.05）

2.2. 測(cè)序結(jié)果圖

用bioedit7.0生物軟件顯示1849位堿其G突變?yōu)門，且突變位點(diǎn)出現(xiàn)套峰，如圖7所示。

圖5 JAK2基因1849位堿基正常測(cè)序圖

3.講論

骨髓增殖性腫瘤（MPNs）是一類起源于多能造血干細(xì)胞，以一系或者多系分化相對(duì)較成熟的骨髓細(xì)胞克隆性增生異常為特點(diǎn)的一組疾病的統(tǒng)稱[1]。增生的細(xì)胞其細(xì)胞形態(tài)和功能相對(duì)正常，常表現(xiàn)為多能髓樣造血干細(xì)胞所屬的細(xì)胞系（包括紅細(xì)胞系、血小板系、粒-單核細(xì)胞系）中的一系或多系細(xì)胞惡性增生；而細(xì)胞形態(tài)和功能相對(duì)正常。常伴有肝脾腫大等外周器官浸潤(rùn)。正由于其具有腫瘤性疾病的特征，在2008年新修訂的WHO慢性髓系腫瘤分類中將既往沿用多年的“慢性骨髓增殖性疾病”舊稱更名為“骨髓增殖性腫瘤”。MPNs包括4種經(jīng)典的MPNs以及非典型的MPNs，前者包括慢性髓性白血病（CML）、真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（PMF），后者包括慢性中性粒細(xì)胞白血?。–NL）、肥大細(xì)胞疾病（MCD）、慢性嗜酸粒細(xì)胞白血?。–EL）和不能分類的MPNs。

研究發(fā)現(xiàn)，90%的PV患者中存在JAK2基因V617F突變，進(jìn)一步研究闡明了其機(jī)理：JAK2基因14號(hào)外顯子第1849位核酸上發(fā)生點(diǎn)突變（G>T）使得JH2區(qū)域的第617位纈氨酸突變?yōu)楸奖彼幔╒>F）。正常情況下，JH2區(qū)域抑制JAK2激酶活性，發(fā)生突變后抑制作用減弱，從而使JAK2激酶活性明顯增強(qiáng)。

迄今為止，臨床主要依靠其臨床表現(xiàn)、血常規(guī)、血清EPO水平、NAP積分、骨髓細(xì)胞形態(tài)或骨髓活檢等進(jìn)行診斷，而且必須排除繼發(fā)性因素，但有時(shí)仍難以與有相似癥狀或血象表現(xiàn)的其他疾病相鑒別，例如繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥，反應(yīng)性血小板增多，類白血病反應(yīng)，MDS等，給我們的診斷造成一定的困難，因此對(duì)該類疾病找到一種可靠的基因標(biāo)記將對(duì)臨床診斷提供很大的幫助。James[2]首先報(bào)道了在PV患者中發(fā)現(xiàn)JAK2V617F點(diǎn)突變，其后在MPNs的其他亞型中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了該突變的存在，但陽(yáng)性率高低不一。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)JAK2V617F點(diǎn)突變?cè)赑V患者中陽(yáng)性率最高，其次為PMF、ET患者，在AML、ALL、CML中為陰性，與國(guó)際上報(bào)道相符[3]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ET患者中JAK2V617F突變與血紅蛋白量、血小板數(shù)量無關(guān)。但國(guó)外有報(bào)道[4][5]ET患者中JAK2V617F點(diǎn)突變陽(yáng)性者血紅蛋白量較高、血小板計(jì)數(shù)較低，故我們的實(shí)驗(yàn)還有待增加病例總數(shù)以便作進(jìn)一步分析。PV患者陰性例數(shù)較少，未做比較。PV和ET陽(yáng)性患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于陰性患者。國(guó)外研究亦發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性患者中白細(xì)胞計(jì)數(shù)高，且可以作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素與血栓形成及骨髓纖維化成正相關(guān)[6]。

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