柯棠山，董 進(jìn)，廖 娟，劉坤祥

(遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及成肌特性

柯棠山，董 進(jìn)，廖 娟，劉坤祥

(遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

目的 建立高純度、高豐度的兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法，并對培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞體外增殖和成肌特性進(jìn)行觀察。方法 采用改良I型膠原酶和胰蛋白酶混合消化法結(jié)合差速貼壁培養(yǎng)以分離、純化1周齡幼兔小腿三頭肌來源的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。鏡下觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞生長形態(tài)，結(jié)蛋白(Desmin)免疫組化染色鑒定體外培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞，MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，并對分離培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌特性進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)觀察。結(jié)果 差速貼壁后的懸浮肌衛(wèi)星細(xì)胞折光性強(qiáng)，呈透亮球形，數(shù)量較多，貼壁生長后逐漸變?yōu)殚L梭形；免疫組化染色檢測分離培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)Desmin，證明為肌衛(wèi)星細(xì)胞，純度高達(dá)95%；傳代培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞24 h后開始增殖，第3～7天處于對數(shù)生長期，第8天后進(jìn)入平臺(tái)期；不經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞也可融合形成肌管，但形成肌管速度不及誘導(dǎo)分化培養(yǎng)組快速。結(jié)論 成功建立了具有操作簡便、不易污染和純度高的兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法,為采用肌衛(wèi)星細(xì)胞為種子細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

肌衛(wèi)星細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；兔

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cells，SC)是一種位于肌纖維肌膜與基底膜之間的多潛能干細(xì)胞，由Mauro首次發(fā)現(xiàn)。肌衛(wèi)星細(xì)胞通常處于有絲分裂靜止期，當(dāng)骨骼肌受到外傷和負(fù)重鍛煉等應(yīng)激刺激時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞即被激活而迅速增殖，補(bǔ)充死亡的肌纖維、修復(fù)損傷的骨骼肌。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞池內(nèi)干細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定，對維持體內(nèi)肌纖維的數(shù)量與生長及損傷后骨骼肌的修復(fù)和再生具有重要意義[1]。高純度的肌衛(wèi)星細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法，是研究肌衛(wèi)星細(xì)胞生物學(xué)特性的重要工具[2]。目前雖有一些文獻(xiàn)報(bào)道體外肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的方法，但對兔衛(wèi)星細(xì)胞的研究較少，且操作步驟粗略,可重復(fù)性低。本實(shí)驗(yàn)擬建立可獲取高純度、較多數(shù)量兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，為后續(xù)的肌衛(wèi)星細(xì)胞移植治療失神經(jīng)肌萎縮研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用1周齡健康新西蘭大白兔，雌雄不限，由遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 HG-DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基由Hyclone公司提供，Ⅰ型膠原酶購于Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和馬血清(horse serum，HS)購自Gibco公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、多聚賴氨酸由Solarbio公司生產(chǎn)，小鼠IgG免疫組化試劑盒(SABC即用型)、Desmin 蛋白抗體及DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物消毒與取材 37 ℃蒸餾水清洗幼兔2次，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡消毒5～10 min，無菌條件取出幼兔后肢小腿三頭肌并去除肌表面的筋膜，放入冰浴的含有雙抗PBS的15 mL離心管，置于超凈臺(tái)。

1.3.2 兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng) 參照黃郁凱等[3]混合酶消化法進(jìn)一步優(yōu)化膠原酶和胰蛋白酶比例及濃度，縮短消化時(shí)間。用含雙抗的PBS沖洗肌塊2次后轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿，用眼科鑷、眼科剪盡可能去除筋膜、神經(jīng)、血管和脂肪組織，除去雜質(zhì)的肌塊轉(zhuǎn)入新的無菌培養(yǎng)皿，充分剪碎肌組織，約1 mm3大小。PBS沖洗，吹打，靜置，棄去漂浮物，重復(fù)2～3次。將剪碎的肌肉組織塊轉(zhuǎn)入無菌錐形瓶，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基、0.2 %膠原酶、0.2 %胰蛋白酶各5 mL，37 ℃水浴消化40 min(期間輕搖動(dòng)錐形瓶，緩速圓周運(yùn)動(dòng)，使肌組織與酶充分接觸)；加含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，收集消化的細(xì)胞懸液和未消化完全的組織塊經(jīng)200目、400目細(xì)胞篩過濾。收集濾液，1000 r/min離心5 min，棄除上清液，在沉淀中加入適量的生長培養(yǎng)基重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，種植密度不低于105個(gè)細(xì)胞/mL。培養(yǎng)條件： HG-DMEM(20%FBS，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 (g/mL)，37 ℃、5%CO2及飽和濕度。差速貼壁3 h，重復(fù)2次。收集上清液，轉(zhuǎn)入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)3 d后第1次換液，以后每隔48小時(shí)換液1次，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。

1.3.3 SC的傳代培養(yǎng) 待6 d左右細(xì)胞匯集達(dá)60%～70%，用0.25%胰蛋白酶充分消化4～6 min，以1∶2比例傳代培養(yǎng)，每隔2天換液1次，倒置顯微鏡下觀察。

1.3.4 MTT法檢測體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長特性 取生長狀態(tài)良好的第3代增殖期細(xì)胞，以8×103/孔接種到96孔板中，每孔培養(yǎng)體系為200μL，置于37 ℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24小時(shí)隨機(jī)選取1組培養(yǎng)板6個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入MTT試劑，測定每個(gè)孔的吸光度值(A)。計(jì)算每天每組6孔的吸光度平均值，繪制肌衛(wèi)星細(xì)胞生長曲線 。

1.3.5 兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌特性觀察 選取第2代肌衛(wèi)星細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以1×105/孔接種于2塊6孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入含20%FBS的HG-DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待培養(yǎng)細(xì)胞增殖至70%～80%匯合時(shí)，其中一板在生長培養(yǎng)基下繼續(xù)培養(yǎng)，另一板改用分化培養(yǎng)基(含2%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，鏡下觀察比較兩板細(xì)胞的排列狀態(tài)、細(xì)胞間的融合及肌管形成的差異。

1.3.6 兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定 選原代培養(yǎng)細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定30 min，蒸餾水沖洗；0.5% Triton-X100 4℃孵育4 h，蒸餾水沖洗；30%H2O21份+純甲醇50份混合，室溫30 min，蒸餾水沖洗；消化酶處理10 min，蒸餾水沖洗；5%BSA 封閉液37 ℃30 min，甩去多余液體；滴加稀釋的抗Desmin蛋白抗體(一抗)，PBS 代替一抗作為陰性對照，4 ℃過夜，PBS沖洗；滴加相應(yīng)的二抗, 37 ℃30 min，PBS沖洗；滴加SABC，37 ℃ 30 min，PBS沖洗；滴加DAB顯色液顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；蘇木素輕度復(fù)染；脫水，透明，封片；顯微鏡觀察，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。

2 結(jié)果

2.1 兔肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 經(jīng)2次差速貼壁后懸浮的細(xì)胞數(shù)量較多，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞球形透亮，折光性強(qiáng)(見圖1A)，視為肌衛(wèi)星細(xì)胞，培養(yǎng)12～14h后細(xì)胞開始貼壁，培養(yǎng)3 d后完全貼壁，細(xì)胞逐漸延伸成紡錘形或長梭形(見圖1B)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞迅速增殖且排列呈現(xiàn)方向性。培養(yǎng)第7天，細(xì)胞開始以長軸平行匯合(見圖1C)，至第14天見整個(gè)視野長梭形細(xì)胞高度匯合(見圖1D)。在生長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，則高度匯合的細(xì)胞開始出現(xiàn)融合，形成多核肌管細(xì)胞，肌管呈長條形，光滑透亮。

A：為2次差速貼壁后的SC細(xì)胞 ×100；B：為原代培養(yǎng)第3天的SC細(xì)胞 ×200；C：為原代培養(yǎng)第7天的SC細(xì)胞 ×200；D：為原代培養(yǎng)第14天的SC細(xì)胞×100。

2.2 體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長特性 傳代培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞系24 h后開始增殖，第3～7天處于對數(shù)生長期，第8天后增殖速度明顯減慢，處于平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞生長匯合度在80%以上(見圖2)。

圖2 SC細(xì)胞生長曲線(MTT法)

2.3 兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌特性 在生長培養(yǎng)基培養(yǎng)下，肌衛(wèi)星細(xì)胞貼壁培養(yǎng)1周左右，細(xì)胞匯集達(dá)60%～70%，開始有散在細(xì)胞相互融合，形成長索形肌衛(wèi)星細(xì)胞鏈(見圖3 A)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞密集，細(xì)胞間的融合更為廣泛，3周左右開始形成粗大透亮的肌管，培養(yǎng)至第30天，肉眼可見培養(yǎng)瓶底部形成膜狀結(jié)構(gòu)(見圖3B)。當(dāng)細(xì)胞增殖至70%～80%匯集時(shí)，改用分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖速度明顯下降，24 h后開始有少量細(xì)胞相互融合，1周可見散在的肌管形成(見圖4A、4B)。

A：生長培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)第7天，SC沿長軸相互連接，呈融合趨勢，形成細(xì)胞鏈 ×200；B：生長培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)第30天，可見多條長條狀透亮的肌管×100。

A、B：誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的SC細(xì)胞，可見到光滑透亮的肌管 ×200。

2.4 兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定 細(xì)胞 Desmin蛋白免疫組化染色顯示兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為強(qiáng)陽性表達(dá)(見圖5)，以PBS代替Desmin抗體作為一抗的免疫組化染色SC顯示為陰性。

A：示胞漿深棕色陽性染色 ×100；B：示蘇木素復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色 ×200。

3 討論

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞由Mauro于1961年首先發(fā)現(xiàn)，電鏡下觀察到其位于基膜和肌細(xì)胞膜之間，緊貼肌細(xì)胞表面而命名為肌衛(wèi)星細(xì)胞。以后進(jìn)一步證實(shí)肌衛(wèi)星細(xì)胞參與了骨骼肌的生長和修復(fù)，具有自我增殖和多向分化的能力，維持著體內(nèi)肌肉干細(xì)胞池的穩(wěn)定，在骨骼肌的生長和再生中起著重要作用[4]。然而，隨著機(jī)體衰老肌衛(wèi)星細(xì)胞池發(fā)生改變，衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量減少，導(dǎo)致了肌肉再生能力下降。一些肌源性疾病如假性肥大型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)患者，由于肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)減少、喪失再生能力，不能滿足機(jī)體對肌衛(wèi)星細(xì)胞持續(xù)需求，導(dǎo)致進(jìn)行性肌肉無力與慢性退化。因此，對DMD患者不斷補(bǔ)充肌衛(wèi)星細(xì)胞視為目前的重要治療手段之一[5]。最近的研究還顯示肌衛(wèi)星細(xì)胞在心肌等疾病的修復(fù)中亦有良好的應(yīng)用前景[6-7]。然而，干細(xì)胞治療的先決條件是獲得穩(wěn)定、可靠和數(shù)量較多的干細(xì)胞。

已經(jīng)報(bào)道有多種分離純化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法，包括肌組織塊酶消化、直接分離單根肌纖維培養(yǎng)和根據(jù)細(xì)胞表面分子標(biāo)志的流式細(xì)胞和免疫磁珠分選等，但效果并不理想。由于肌衛(wèi)星細(xì)胞所處的位置，細(xì)胞連接緊密，單純用膠原酶消化并不能有效將肌束上的衛(wèi)星細(xì)胞分離且耗時(shí)；單根肌纖維培養(yǎng)獲得的肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量有限；而培養(yǎng)條件不同，細(xì)胞表面分子標(biāo)志發(fā)生變化，將影響流式細(xì)胞和免疫磁珠分選的結(jié)果，也給后續(xù)的擴(kuò)增和應(yīng)用帶來不利影響。不同年齡、不同骨骼肌類型中肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目不同，年幼個(gè)體的衛(wèi)星細(xì)胞含量較豐富，慢肌比快肌衛(wèi)星細(xì)胞含量多，所以實(shí)驗(yàn)取材對象和部位的選擇十分重要[2]。

在肌衛(wèi)星細(xì)胞純化方面，有文獻(xiàn)報(bào)道采用Percoll 液梯度離心法[8]，但存在程序繁瑣、細(xì)胞損失大、易污染等缺點(diǎn)。黃郁凱等[3]采用懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得大鼠骨骼肌干細(xì)胞團(tuán)，批量擴(kuò)增骨骼肌干細(xì)胞，模擬了組織的三維結(jié)構(gòu)，但也存在細(xì)胞成團(tuán)慢、雜質(zhì)細(xì)胞多等不足。本實(shí)驗(yàn)從兔后肢的慢肌小腿三頭肌取材，使用膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化分離方法，可以發(fā)揮疊加作用，使肌肉組織充分消化釋放出肌衛(wèi)星細(xì)胞，并減少消化的總體時(shí)間，降低消化酶對細(xì)胞的損傷，同時(shí)消化期間改用輕輕搖動(dòng)錐形瓶做緩速圓周運(yùn)動(dòng)，去除了既往SC提取方法中消化期間需反復(fù)吹打的繁瑣步驟，減少操作污染的幾率。采用傳統(tǒng)的2次差速貼壁就可以獲得較高純度的衛(wèi)星細(xì)胞。鑒于衛(wèi)星細(xì)胞貼壁慢，采用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，取得了良好的貼壁效果。Desmin是一種分子量為56ku的中間絲蛋白，在維持骨骼肌細(xì)胞的完整性以及肌小節(jié)之間的信息傳遞中發(fā)揮作用，是肌組織的特異性標(biāo)記[9]。本實(shí)驗(yàn)對分離培養(yǎng)的目的細(xì)胞經(jīng)抗結(jié)蛋白( Desmin) 抗體免疫組化染色結(jié)果呈陽性，純度高達(dá)95%，進(jìn)一步證實(shí)為肌衛(wèi)星細(xì)胞。我們的結(jié)果表明，在未使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞仍可融合形成肌管，需要20 d，使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基馬血清后，卻只要7d就可見肌管形成，這提示使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基可為SC分化培養(yǎng)贏得時(shí)間。

近年來隨著干細(xì)胞的研究和探索，進(jìn)一步的發(fā)展，干細(xì)胞的應(yīng)用逐漸廣泛，但仍然存在多方面的不足，如來源有限，獲取困難等，不能很好的解決應(yīng)用于臨床問題[10]。肌衛(wèi)星細(xì)胞作為骨骼來源的干細(xì)胞，在組織工程應(yīng)用如骨骼肌、心肌、骨、軟骨等的修復(fù)重建等具有廣闊的前景和實(shí)用價(jià)值。我們采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化和差速貼壁離心相結(jié)合的分離純化方法，得到的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量較多且效果較好，可為上述應(yīng)用前景提供基礎(chǔ)。

[1] Kuang S, Kuroda K, Le Grand F, et al. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle[J]. Cell, 2007, 129(5): 999-1010.

[2] Danoviz M E, Yablonka-Reuveni Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system[J].Methods mol Biol,2012,798:21-52.

[3] 黃郁凱, 李曉紅, 潘宇,等. 成年大鼠骨骼肌干細(xì)胞的制備與新型培養(yǎng)方法[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(1): 183-187.

[4] Bareja A, Holt J A, Luo G, et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis[J].Plos One,2014,9(2):e90398.

[5] Motohashi N, Asakura A. Muscle Satellite Cell Heterogeneity and self-Renewal[J].Front Cell Dey Biol, 2014, 2: 1.

[6] Tedesco F S, Dellavalle A, Diaz-Manera J, et al. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells[J]. J Clin Invest, 2010, 120(1): 11-19.

[7] Sambasivan R, Tajbakhsh S. Skeletal muscle stem cell birth and properties[J].Semin Cell Dev Biol,2007, 18(6): 870-882.

[8] 張玉石, 李漢忠, 張銳強(qiáng), 等. 應(yīng)用 Percoll 分離純化組織工程用肌衛(wèi)星細(xì)胞[J]. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 28(2): 182-185.

[9] Cornelison D D, Wold B J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells[J].Dev Biol, 1997, 191(2): 270-283.

[10] 郭常敏, 王達(dá)利, 魏在榮,等. 人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)鑒定與誘導(dǎo)分化的初步研究[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 36(1):32-36.

[收稿2014-12-15;修回2015-03-07]

(編輯：譚秀榮)

Separation and culture of rabbit skeletal muscle satellite cells and evaluation of their myotube formation capability in vitro

KeTangshan,DongJin,LiaoJuan,LiuKunxiang

(Research Center for Medicine & Biology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To establish the methods for the separation and culture of rabbit skeletal muscle satellite cells and evaluate their myotube formation capability. Methods Skeletal muscle satellite cells from 1-week-old rabbit triceps surae were isolated and pured by improved collagenase-Ⅰ and trypsin digestion using different adhesion method. The morphology of satellite cells was observed under microscope. Desmin immunohistochemical staining was used for the identification of satellite cells. MTT assay was used for drawing the cell growth curve. The induction culture and characteristics of myotube formationin vitro was observed. Results After twice differential adherence, the number of suspended cells with strong refraction was increased rapidly, and cells gradually became long-shuttle in shape. The strong positive expression was detected by desmin immunohistochemical staining. The purity was up to 95%. The satellite cells began to proliferate after 24 h. It was in logarithmic growth and platform phase after subcultured for 3rd-7th day and 8th day, respectively. Without the induced differentiation culture medium, the satellite cells could still fuse to form myotubes. However, the speed of myotube formation was slower than that with induced differentiation culture medium. Conclusion This experiment has successfully established methods for separation and culture of rabbit skeletal muscle satellite cells with easy operation, little pollution and high purity, which provide the basis for the experimental foundation of regeneration medicine research.

skeletal muscle satellite cell; cell culture; rabbit

遵義市科技局基金資助項(xiàng)目(NO：E-072)

劉坤祥，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：骨骼肌神經(jīng)生物醫(yī)學(xué)工程,E-mail:liukunxiang01@163.com。

R322-32

A

1000-2715(2015)02-0150-04