龍艷麗 ，胡 勇，余 艦，張麗娟，楊 陽

(1.貴州省人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550002；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 司法醫(yī)學(xué)鑒定中心，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

孕兔羊水栓塞補(bǔ)體C3a、凝血功能的研究

龍艷麗1，胡 勇2，余 艦2，張麗娟3，楊 陽3

(1.貴州省人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550002；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 司法醫(yī)學(xué)鑒定中心，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099)

目的 通過孕兔羊水栓塞動物模型測定凝血功能、補(bǔ)體C3a的含量以及補(bǔ)體C3a在肺組織中的表達(dá)，初步探索羊水栓塞(AFE)的發(fā)病機(jī)制。方法 健康妊娠晚期孕兔隨機(jī)分3組(對照組、羊水組、羊水胎糞組)，暴露子宮抽取羊水、胎糞。按2.5 mL/Kg注入自體羊水、羊水胎糞混合液(羊水原液與胎糞按質(zhì)量比配成1%混合液)入血，對照組注入等劑量生理鹽水。注射30 min后取血分別用血凝儀測凝血功能(凝血酶原時間 (PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、纖維蛋白原 (FIB))及ELISA法測血漿補(bǔ)體C3a含量。取血后10%KCl處死孕兔，取孕兔雙肺做病理學(xué)檢查。結(jié)果 ①補(bǔ)體C3a濃度：羊水組、羊水胎糞組補(bǔ)體C3a含量降低(P<0.05)；②凝血功能檢查結(jié)果：PT、APTT、TT羊水組、羊水胎糞組延長(P<0.05)，F(xiàn)IB羊水組、羊水胎糞組降低(P<0.05)。結(jié)論 ①發(fā)生AFE時補(bǔ)體C3a含量降低，說明補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，消耗補(bǔ)體成分發(fā)生類過敏反應(yīng)；②AFE時PT、TT、APTT均延長，F(xiàn)IB降低，說明AFE時有發(fā)展為DIC的趨勢。

羊水栓塞；凝血功能；補(bǔ)體C3a；免疫組織化學(xué)染色；類過敏反應(yīng)

羊水栓塞(Amniotic Fluid Embolism，AFE)是嚴(yán)重分娩并發(fā)癥，至今仍然是威脅母親生命健康的重要原因之一。AFE的發(fā)病率為4/10萬～6/10萬，發(fā)生于足月妊娠時產(chǎn)婦的死亡率高達(dá)80%[1]。AFE發(fā)病急、病程進(jìn)展迅速、死亡率較高，使得對該病的病因、臨床發(fā)展過程、發(fā)病機(jī)理的研究帶來了一定的難度。本實(shí)驗(yàn)通過健康妊娠晚期家兔建立AFE動物模型，檢測補(bǔ)體C3a含量、凝血功能以及補(bǔ)體C3a在AFE時肺組織中的表達(dá)來初步探討AFE的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康妊娠晚期家兔(購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué))體重4～5 kg，胎齡25～31 d。隨機(jī)分為3組：正常組、羊水組、羊水胎糞組，每組各10只。

1.2 儀器 LEICA-RMEB5石蠟切片機(jī) (德國LEICA公司)、普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、酶標(biāo)儀(Biotek公司(型號ELX800))、血凝儀。

1.3 試劑 補(bǔ)體C3a(兔抗人，北京博奧森公司)、CK(兔抗人，北京博奧森公司)、補(bǔ)體C3a ELISA試劑盒(昆明綠盟科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 羊水、胎糞收集方法 孕兔術(shù)前12 h禁食，飲水任意，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg沿耳緣靜脈注射麻醉，麻醉生效后仰臥位固定于兔臺上，下腹正中切開，行子宮次全切除術(shù)后關(guān)腹。將切下的子宮用溫鹽水紗布覆蓋，打開宮壁，暴露胎膜，20 mL注射器穿刺抽取羊水。打開胎兔腹壁，取出胎兔大腸，將胎糞輕輕擠壓出來，用勻漿器磨碎，與自體羊水原液按質(zhì)量比配成1%的羊水胎糞液。

1.4.2 兔羊水栓塞模型的構(gòu)建 羊水組、羊水胎糞組孕兔分別沿耳緣靜脈按2.5 mL/kg自體注入已制備好的羊水、1%羊水胎糞液(羊水原液與胎糞按質(zhì)量比配成1%混合液)注射液,對照組按2.5 mL/kg沿耳緣靜脈注入生理鹽水。分別在注射前、注射后30 min從兔耳緣靜脈取血備用，若觀察過程中出現(xiàn)死亡立即取血備用；分別查凝血功能(PT、TT、APTT、FIB)及離心3 000 r/min，15 min，取其上清液于-20 °C保存?zhèn)溆?，ELISA法測補(bǔ)體C3a的含量。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry，IHC) 取孕兔雙肺用10%中性福爾馬林固定48 h后常規(guī)取材、石蠟包埋并HE染色。觀察HE切片選取羊水組、羊水胎糞組肺血管內(nèi)含羊水有形成分的蠟塊連續(xù)切片，厚約4μm行IHC標(biāo)記。對照組采用相同的方法HE染色并IHC標(biāo)記。IHC采用Envison法，DAB顯色(DAB按1∶50稀釋)。組織抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)。補(bǔ)體C3a稀釋濃度為1∶300，CK(細(xì)胞角蛋白)稀釋濃度為1∶400。

1.5 結(jié)果處理

1.5.1 IHC標(biāo)記陽性結(jié)果判斷 CK陽性結(jié)果判斷：肺小動脈或者肺毛細(xì)血管內(nèi)出現(xiàn)棕黃色。補(bǔ)體C3a陽性結(jié)果判斷：肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色染色為陽性，淡棕黃色為弱陽性。

2 結(jié)果

2.1 孕兔在注射前、后的臨床表現(xiàn) 對照組注入生理鹽水后孕兔無不適臨床表現(xiàn)，呼吸、心跳節(jié)律適中，無口唇、鼻尖青紫，無大小便失禁。羊水組注入羊水原液后孕兔表現(xiàn)為呼吸急促、躁動，口唇、鼻尖輕度青紫，部分孕兔出現(xiàn)大小便失禁，30 min內(nèi)無孕兔死亡。羊水栓塞組注入羊水胎糞液后孕兔表現(xiàn)為呼吸急促、躁動、抽搐、口吐白沫，口唇和鼻尖中、重度青紫，大小便失禁，5 min內(nèi)孕兔全部死亡。

2.2 孕兔在注射前、后凝血功能的變化情況(見表1、表2)

組別PT注射前注射后APTT注射前注射后對照組8．63±1．088．8±0．89 31．19±9．2631．62±9．06羊水組8．84±1．3310．94±2．09?#36．83±10．8668．28±28．25?#羊水胎糞組8．99±1．5313．73±2．87?#35．36±8．5673．86±20．49?#

*與本組注射前比較P<0.05,#與對照組注射后比較P<0.05。

組別TT(s)注射前注射后FIB(g/L)注射前注射后對照組15．86±1．6116．28±1．702．29±0．432．20±0．46羊水組14．23±0．7625．95±3．09?#2．26±0．401．37±0．47?#羊水胎糞組14．82±1．1031．62±6．56?#2．31±0．411．28±0．32?#

*與本組注射前比較P<0.05，#與對照組注射后比較P<0.05。

2.3 孕兔在注射前、后血漿補(bǔ)體C3a濃度(見表3)

組別注射前注射后對照組23．70±1．7322．54±1．75羊水組23．37±1．4218．45±5．16?羊水胎糞組23．17±1．9814．79±2．76?#

*與本組注射前比較P<0.05，#與對照組注射后比較P<0.05。

2.4 病理檢查結(jié)果

2.4.1 對照組肺組織HE染色未見肺水腫，肺血管內(nèi)未見角化鱗狀上皮等羊水有形成分。羊水組、羊水胎糞組肺組織HE染色可見不同程度的肺水腫，肺血管內(nèi)見角化的鱗狀上皮等羊水有形成分(見圖1)。

2.4.2 對照組肺血管內(nèi)CK免疫組化染色未見角化的鱗狀上皮等羊水有形成分。羊水組、羊水胎糞組CK免疫組化染色肺血管內(nèi)可見呈棕黃色、絲狀的角化鱗狀上皮(見圖2)。

2.4.3 對照組補(bǔ)體C3a免疫組化染色肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞漿呈棕黃色，強(qiáng)陽性。羊水組、羊水胎糞組補(bǔ)體C3a免疫組化染色肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞漿表達(dá)較對照組弱，呈弱陽性(見圖3)。

A：羊水組；B：羊水胎糞組；C：正常組。

A：羊水組；B：羊水胎糞組；C：正常組。

A：對照組；B：羊水組；C：羊水胎糞組。

3 討論

羊水栓塞自1926年Meyer[2]第一次提出以來，對于AFE的發(fā)病機(jī)制、診斷標(biāo)準(zhǔn)目前暫未有統(tǒng)一的定論。AFE臨床表現(xiàn)呈多樣性但是缺乏特異性。Bonson等[3]認(rèn)為AFE的本質(zhì)可能是沒有抗體參加的過敏反應(yīng)，建議將AFE改名為“懷孕過敏反應(yīng)綜合征”。Vittoro Fineschi[4]等研究發(fā)現(xiàn)羊水栓塞組與對照組相比，羊水栓塞組補(bǔ)體C3a的量比對照組低(P<0.05)，提示發(fā)生AFE時可能是補(bǔ)體系統(tǒng)被激活。

本實(shí)驗(yàn)通過孕兔回輸自體羊水、羊水胎糞混合液建立AFE動物模型[5-6]，初步探討AFE的發(fā)病機(jī)制。羊水組、羊水胎糞組補(bǔ)體C3a含量降低(P<0.05)，而對照組無明顯變化(P>0.05)，且羊水組、羊水胎糞組肺組織補(bǔ)體C3a免疫組織化學(xué)染色呈弱陽性表達(dá)，說明補(bǔ)體系統(tǒng)被大量激活。這與盧穎州[7]等研究一致。羊水組、羊水胎糞組凝血功能PT、APTT、TT均延長(P<0.05)，F(xiàn)IB含量降低(P<0.05)，而對照組無此變化，說明發(fā)生AFE時血液處于高凝狀態(tài)有發(fā)生DIC的趨勢。這與任廣睦[8]等的研究一致。

既往研究理論無法解釋補(bǔ)體活化現(xiàn)象[9]。盧穎州[7]等研究發(fā)現(xiàn)AFE的本質(zhì)是類過敏反應(yīng)。類過敏反應(yīng)的特點(diǎn)是無IgE介導(dǎo)，首次接觸即可發(fā)生，其發(fā)生機(jī)制與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，組胺等的釋放有關(guān) 。在正常生理狀態(tài)下，補(bǔ)體在清除病原微生物、處理免疫復(fù)合物等方面發(fā)揮重要作用，但其異常過度活化是許多臨床疾病發(fā)生的基礎(chǔ)[4]。國內(nèi)學(xué)者通過動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)注射羊水及胎糞液羊水后血清補(bǔ)體C3的量降低，由此說明了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活消耗在AFE中起了一定的作用，可能是AFE的主要原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羊水組、羊水胎糞組在分別注射羊水、羊水胎糞混合液后各項(xiàng)凝血指標(biāo)均有變化(FIB降低，PT、TT、APTT均延長)，說明AFE發(fā)生早期有并發(fā)DIC的趨勢。休克與DIC也有相互促進(jìn)的作用，在諸多因素的共同作用下才最終導(dǎo)致嚴(yán)重的凝血功能障礙直至發(fā)生DIC。為此，可以對疑似AFE患者檢測凝血功能，對明確診斷或許有幫助。

目前，對于AFE的發(fā)病機(jī)理及診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然沒有達(dá)成統(tǒng)一的共識。由于AFE發(fā)病急、死亡率高的自身特點(diǎn)使得對AFE的認(rèn)識力度不夠。因此，臨床懷疑AFE時可聯(lián)合查患者凝血功能、補(bǔ)體C3a含量等指標(biāo)協(xié)助診斷，爭取做到早診斷、早治療、預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥，降低產(chǎn)婦羊水栓塞發(fā)病率。 同時，也為AFE的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

[1] 樂杰，謝幸，林仲秋，等.婦產(chǎn)科學(xué)[M].第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：208-210.

[2] Meyer J R.Embolia pulmonar amnio caseosa [J].Bras Med,1926,2:301-303.

[3] Benson M D.A hypothesis regarding complement activatinon and amniotic fluid embolism[J].Med Hypotheses，2007,68(5):1019-1025.

[4] Fineschi V,Riezzo L,Cantatore S,et al.Complement C3a expression and tryptase degranulation as promising histopathological tests for diagnosing fatal amniotic fluid embolism[J].Virchows Arch,2009,454(3):283-290.

[5] Benson M D. Current concepts of immunology and diagnosis in amniotic fulid embolism[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:946576.

[6] 趙敏，張國棟，余艦.實(shí)驗(yàn)性大鼠羊水栓塞角蛋白16表達(dá)的變化及意義[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，17(32)：2750-2751.

[7] 盧穎州，高謀.孕鼠羊水栓塞補(bǔ)體C3、C4和B因子的動態(tài)變化及意義[J].山西醫(yī)藥雜志，2014,15(3)：220-222.

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[收稿2014-12-05;修回2015-01-28]

(編輯：譚秀榮)

Study on complement C3a and coagulation function in amniotic fluid embolism of pregnant rabbits

LongYanli1,HuYong2,YuJian2,ZhangLijuan3,YangYang3

(1. Department of Pathology , Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang Guizhou 550002, China; 2. Forensic Medicine Center,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3.Department of Forensic Pathology,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To determine the coagulation function and complement C3a content in amniotic fluid embolism of pregnant rabbit model and complement C3a expression in lung tissue and explore the pathogenesis of amniotic fluid Embolism.Methods Healthy trimester pregnant rabbits were randomly divided into the control, amniotic fluid and meconium groups. After the uterus exposure, the amniotic fluid and meconium were extracted. Rabbits

autologous amniotic fluid and meconium mixture (2.5 ml/kg) at the quality ratio of meconium and amniotic liquid matched into 1% mixture along the ear vein injection, while the control group was given the volume-matched saline. Thirty minutes after injection, the prothrombin time (PT), the activated partial thromboplastin time (APTT), the thrombin time (TT) and fibrinogen (FIB) were measured by coagulometer. Serum complement C3a content was detected by ELISA. The pathological examination of pregnant rabbit lungs was performed.Results The complement C3a level in amniotic fluid and meconium groups was lower than that in the control group. Compared with the control group, PT, APTT and TT in amniotic fluid and meconium groups were prolonged and FIB in amniotic fluid and meconium groups was decreased.Conclusion 1) In amniotic fluid embolism, the complement C3a was reduced, suggesting that the complement system is activated and the complement component is consumed and anaphylactoid reaction occurs.2) In amniotic fluid embolism, PT, TT and APTT are prolonged and FIB is decreased, suggesting that amniotic fluid embolism might develop to DIC.

amniotic fluid embolism; coagulation; complement C3a; immunohistochemistry; anaphylactoid reactions

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字[2012]2358)。

余艦，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：羊水栓塞發(fā)病機(jī)制，E-mail:783065265@qq.com。

R714.46

A

1000-2715(2015)02-0164-04