張志勇 楊水珍

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二苯乙烯苷對低氧肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

張志勇 楊水珍

目的 探討二苯乙烯苷對低氧肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖的影響及其機(jī)制。 方法 SD大鼠PASMCs經(jīng)低氧及TSG干預(yù)24h后， CCK-8檢測細(xì)胞增殖及TSG的細(xì)胞毒作用，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測HIF-1α mRNA的表達(dá)，酶標(biāo)儀檢測活性氧(ROS)的產(chǎn)生。結(jié)果 二苯乙烯苷能夠抑制低氧PASMCs增殖，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1～S期，并且實(shí)驗(yàn)濃度的二苯乙烯苷無明顯細(xì)胞毒作用，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷能夠抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生。結(jié)論 二苯乙烯苷可抑制低氧PASMCs增殖，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)及ROS產(chǎn)生有關(guān)。

低氧 肺動脈平滑肌細(xì)胞 二苯乙烯苷 增殖

低氧肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)是慢性低氧肺動脈高壓的重要病理生理基礎(chǔ)，其對低氧肺動脈高壓的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后具有重要意義。低氧肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)的異常增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積，可導(dǎo)致肺血管壁變厚、管腔狹窄順應(yīng)性降低是導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的基礎(chǔ)，低氧肺血管重構(gòu)的機(jī)制目前尚未完全闡明[1,2]。二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside，TSG)是從中藥何首烏分離的一種主要有效活性成分單體，研究表明TSG可通過調(diào)節(jié)NO、血管內(nèi)皮生長因子、MMP-2/9等的表達(dá)，抑制血管的內(nèi)膜增厚及脂質(zhì)沉積[3,4]。研究還發(fā)現(xiàn)，TSG通過調(diào)節(jié)ERK1/2和NO/cGMP/PKG信號通路，抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖，起到抑制動脈粥樣硬化的作[5,6]。有關(guān)TSG在低氧PASMCs增殖中的作用及其機(jī)制未見相關(guān)研究。本研究通過觀察低氧條件下TSG對大鼠PASMCs增殖影響，從細(xì)胞水平探討TSG對低氧肺血管重構(gòu)的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1.材料：SD大鼠(150～200g)購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；Ⅰ膠原酶、溴化乙錠(PI)、RNA酶、DCFH-DA購自Sigma公司； CCK-8試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、雙抗(青霉素+鏈霉素)、胎牛血清等購自Hyclone公司； HIF-α抗體以及GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司。低氧培養(yǎng)箱購自Coylab公司，熒光酶標(biāo)儀購自Bio-Tek公司。

2.SD大鼠PASMCs原代培養(yǎng)：采用0.2% Ⅰ膠原酶消化分離PASMCs，細(xì)胞傳至第3代時(shí)經(jīng)SM-α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞鑒定(純度>95%)，使用0.25%的胰酶消化PASMCs并以1∶2的比例傳代，4～10代細(xì)胞生長穩(wěn)定用于本研究。

3.實(shí)驗(yàn)分組：①空白對照組;②低氧組;③10μmol/L TSG低氧組;④20μmol/L TSG低氧組;⑤50μmol/L TSG低氧組。常氧組采用95%空氣+5%CO2培養(yǎng)，低氧培養(yǎng)采用低氧培養(yǎng)采用 3%O2、92%N2和 5%CO2培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右時(shí)，采用不含血清的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞24h，完全排除血清的影響后，分別進(jìn)行常氧或低氧培養(yǎng)，其中TSG干預(yù)組給予不同濃度的TSG預(yù)處理2 h后進(jìn)行低氧培養(yǎng)。

4.PCR檢測HIF-1α：細(xì)胞生長于6孔板，冷PBS洗滌兩次，每孔加入1ml TRIzol提取細(xì)胞的總RNA，采用紫外分光光度法測定其含量與純度。 取大約5μl總RNA，使用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增后采用GAPDH比較得出標(biāo)準(zhǔn)化值。引物序列為：GAPDH：上游引物：5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′，下游引物：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′；HIF-1α：上游引物：5′-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3′，下游引物：5′-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3′。

5.CCK-8檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒作用：將細(xì)胞接種至96孔板中，各組低氧或常氧培養(yǎng)24h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3h，測定450nm吸光度。

6.細(xì)胞周期檢測：細(xì)胞接種至6孔板中，各組低氧或常氧培養(yǎng)24h后，胰酶消化并收集細(xì)胞，70%乙醇(無水乙醇+PBS)于4℃固定過夜。1500r/min離心5min，1ml的PBS洗細(xì)胞2次， 加入485μl PBS重懸細(xì)胞、Triton X-100 1μl、1mg/ml RNase 5μl、 1mg/ml溴化乙錠(PI)10μl，4℃避光孵育30min后，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

7.ROS的檢測：將細(xì)胞以100μl，5×103/孔均勻接種于96孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無血清的培養(yǎng)基饑餓24h，然后采用不同處理因素干預(yù)24h，將96孔板中的培養(yǎng)基換為用無血清培養(yǎng)液稀釋終濃度為10μmol/L DCFH-DA，繼續(xù)孵育20min之后將培養(yǎng)基吸出，使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以排除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的DCFH-DA的影響，最后再次加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100μl，置于酶標(biāo)儀下檢測，激發(fā)光波長為485nm，發(fā)射光波長為525nm。

結(jié) 果

1.TSG能夠抑制低氧PASMCs增殖：低氧刺激24h能夠促進(jìn)PASMCs增殖 (P<0.05)，TSG(10、20、50μmol/L)抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖具有濃度依賴性(P<0.05，圖1)。

圖1 TSG對低氧PASMCs增殖的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05，與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

2.TSG對PASMCs存活率無影響：結(jié)果顯示，與對照組相比，3種藥物濃度(10、20、50μmol/L)二苯乙烯苷干預(yù)24h對PASMCs的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 TSG對PASMCs存活率的影響(n=6)

3.TSG可抑制PASMCs細(xì)胞周期于G0/G1期：低氧刺激PASMCs 24h后，處于G0/G1細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例增加。與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組相比TSG(10、20、50μmol/L)可使G0/G1細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例增加(P<0.05)，對G2/M期細(xì)胞比例無明顯影響(P>0.05)。結(jié)果表明TSG可阻滯PASMCs細(xì)胞周期于G0/G1(圖3)。

圖3 TSG對PASMCs細(xì)胞周期的影響(n=6)

4.TSG可抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)：與對照組相比，低氧刺激PASMCs 24 h后，PASMCs內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)增加(P<0.05)。與0μmol/L二本乙烯苷+低氧組相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)，且具有濃度依賴性(P<0.05，圖 4)。

圖4 TSG對HIF-1αmRNA的表達(dá)的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05;與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

5.TSG可抑制ROS產(chǎn)生：與對照組相比，低氧刺激PASMCs 24h后，PASMCs內(nèi)ROS增加(P<0.05)，與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組相比，TSG(10、20、50μmol/L)可抑制PASMCs內(nèi)ROS產(chǎn)生，且具有濃度依賴性(P<0.05，圖 5)。

圖5 TSG對ROS產(chǎn)生的影響(n=6)與對照組比較，#P<0.05；與0μmol/L二苯乙烯苷+低氧組比較，*P<0.05

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)， TSG抑制低氧PASMCs增殖，并且實(shí)驗(yàn)濃度的TSG對PASMCs無明顯毒性作用。本研究還表明TSG是通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期抑制低氧PASMCs增殖。進(jìn)一步的研究表明，TSG抑制PASMCs增殖的機(jī)制是通過降低細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)及ROS產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果提示，TSG可抑制PASMCs增殖，繼而低氧肺血管重構(gòu)。

低氧能夠使肺動脈壁各層細(xì)胞一系列結(jié)構(gòu)和功能的變化，尤其是中膜層PASMCs的異常增殖在低氧肺血管重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7,8]。細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控，正常生理情況下PASMC處于靜止G0期，肺血管重構(gòu)時(shí)需要處于靜止G0期PASMCs進(jìn)入和通過細(xì)胞周期各階段[9]。本研究表明TSG可抑制PASMCs細(xì)胞周期于G0/G1期，從而抑制低氧PASMCs增殖。

HIF-1是低氧條件下廣泛表達(dá)于哺乳動物和人體的一種轉(zhuǎn)錄因子，由一個(gè)由調(diào)節(jié)性亞基HIF-1α和一個(gè)構(gòu)成性亞基HIF-1β組成，HIF-1α決定HIF-1的活性，HIF-1α常氧條件下會經(jīng)泛素途徑降解而喪失活性，低氧時(shí)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合形成二聚體后調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是細(xì)胞適應(yīng)低氧的核心調(diào)控因子，與低氧性肺動脈高壓和肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖關(guān)系密切[10]。HIF-1α可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的以及調(diào)節(jié)多種活性介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而刺激肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖[11]?；钚匝踝?reactive oxygen species, ROS)是起源于線粒體呼吸鏈和電子傳遞鏈的反應(yīng)分子和自由基，作為細(xì)胞內(nèi)信號分子，參與細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控。低氧條件下PASMCs內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，運(yùn)用抗氧化劑清除ROS，可以抑制低氧PASMCs增殖[12]。研究表明ROS可能是通過調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)及活性來調(diào)控低氧PASMCs增殖[12,13]。另外ROS還可以通過調(diào)控ERK1/2信號通路促進(jìn)低氧PASMCs增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧能夠促進(jìn)PASMCs 內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)及ROS產(chǎn)生，而TSG可抑制PASMCs內(nèi)HIF-1α mRNA的表達(dá)及ROS產(chǎn)生。因此，推測TSG抑制低氧PASMCs增殖機(jī)制可能與抑制HIF-1α mRNA的表達(dá)及ROS產(chǎn)生有關(guān)。TSG有可能對低氧肺血管重構(gòu)起到抑制作用。

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(修回日期：2015-02-26)

Effect of 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the Proliferation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells Induced by Hypoxia.

ZhangZhiyong，YangShuizhen.

ZhongxiangPeople′sHospital,Hubei431900,China

Objective To investigate the effects of the 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia, in orde to search new drugs for the treatment and prevention of hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods 3% O2hypoxia was used to induced the proliferation of PASMCs. After hypoxic and TSG treatment for 24h, cell growth was determined by cell counting kit-8 (CCK-8), cell cycle was analysed by flow cytometry, the mRNA expression of HIF-1α was measured by quantitative real-time PCR, and the reactive oxygen species (ROS) production was determined by the fluorescence microplate reader. Results TSG can block the proliferation of PASMCs through G0/G1to S phase of the cell cycle arrest without cell cytotoxicity. Further experiments showed that TSG blocking the proliferation of PASMCs was associated suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS in hypoxia- stimulated-PASMCs. Conclusion TSG can inhibit the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells induced by hypoxia through suppression the mRNA expression of HIF-1α and the production of intracellular ROS.

Hypoxia; Pulmonary artery smooth muscle cells; 2,3,4′,5-Tetrahydroxystilbene-2-O-beta-D-glucoside; Proliferation

431900 鐘祥市人民醫(yī)院耳鼻喉科(張志勇)，呼吸科(楊水珍)

張志勇，電子信箱：zhangzhiyong2014@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.043

2015-02-05)