宋明芬 王玉文 董介正 章 隆 施劍飛 張永華

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抑郁模型大鼠不同部位miR-16表達(dá)及其與5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)聯(lián)性研究

宋明芬 王玉文 董介正 章 隆 施劍飛 張永華

目的 研究miR-16在慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁癥模型大鼠神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的表達(dá)及其與5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)聯(lián)性。方法 對(duì)照組和慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型組大鼠各10只，模型組大鼠接受21天的不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激，對(duì)照組大鼠正常飼養(yǎng)。兩組大鼠麻醉后收集腦脊液，測定miR-16。然后斷頭處死，分離前額葉皮質(zhì)、中縫核、海馬，測定miR-16和5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白。結(jié)果 模型組大鼠腦脊液和中縫核的miR-16相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，中縫核miR-16與5-HT胺轉(zhuǎn)運(yùn)體呈負(fù)相關(guān)；而前額葉皮質(zhì)和海馬中的miR-16、5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體分別與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 中縫核miR-16可能通過調(diào)節(jié)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，參與抑郁癥的病理過程，腦脊液miR-16亦可能與抑郁癥相關(guān)。

慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型 miR-16 5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體

世界衛(wèi)生組織公布，抑郁癥已成為世界第4大疾患，預(yù)計(jì)到2020年，可能成為僅次于冠心病的第2大疾病[1]。抑郁癥具有患病率高(終生患病率女性為10%～25%、男性為5%～12%)、復(fù)發(fā)率高(1年30%，5年70%)、自殺率高(10%～25%)等特點(diǎn)，是全球性公共衛(wèi)生問題之一，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來極大的精神損失和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2～4]。然而，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未清楚，給該病的診斷和治療帶來極大困難。microRNAs(miRNAs)是近年來表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，是一類進(jìn)化保守的、18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，通過與靶基因的mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, UTR)結(jié)合，引起mRNA的降解或者翻譯的抑制，從而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，在生物發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5, 6]?，F(xiàn)有的研究揭示，miR-16可能與抑郁癥相關(guān)，其參與抑郁癥的機(jī)制，可能是其在腦組織中以5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter, SERT)基因作為靶基因，參與SERT翻譯水平的調(diào)控，從而影響腦組織內(nèi)5-HT神經(jīng)遞質(zhì)功能發(fā)揮[7, 8]。但至今尚未明確神經(jīng)系統(tǒng)中的哪些部位參與抑郁癥的發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型，比較抑郁模型組和對(duì)照組miR-16在不同部位(腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核)的差異，以及分析miR-16與SERT蛋白的相關(guān)性，旨在探明miR-16參與抑郁癥的作用部位及其機(jī)制，為弄清抑郁癥的發(fā)病機(jī)制以及尋找合適的生物學(xué)標(biāo)志物提供參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)雌性SD大鼠20只，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033，體重約150g，隨機(jī)分成對(duì)照組(10只)和抑郁模型組(10只)。飼養(yǎng)室溫度23±1℃, 相對(duì)濕度55%±5%。

2.抑郁模型建立：慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)模型組大鼠每天隨機(jī)接受以下刺激中的1種：4℃冰水浴5min、禁水24h、晝夜跌倒、懸尾10min、45℃高溫5min、禁食48h、鼠籠傾斜24h、潮濕墊料24h、夾尾1min、束縛應(yīng)激2h，連續(xù)3周。對(duì)照組大鼠每天12h明亮(8:00～20:00)、12h黑暗(20:00～8:00)，自由攝食飲水。

3.抑郁行為評(píng)定：采用糖水消耗實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)評(píng)定抑郁樣行為。(1)糖水消耗實(shí)驗(yàn)：造模前和造模后各1次，分3天完成，第1天將大鼠單籠飼養(yǎng)，給予2瓶1%的蔗糖水；第2天，將其中1瓶蔗糖水換成自來水，進(jìn)行蔗糖水偏好訓(xùn)練。第3天，大鼠禁水23h后，給予1瓶1%蔗糖水和1瓶自來水，計(jì)算1h內(nèi)蔗糖水和自來水消耗量，進(jìn)行糖水偏好率測定。糖水偏好率(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+自來水消耗量)×100%。(2)曠場實(shí)驗(yàn)：長寬高分別100cm、100cm和60cm的容器，底部等分為面積相等的25格，內(nèi)壁為黑色，容器正上方放置一個(gè)攝像頭，將單只大鼠放入中央，紀(jì)錄3min內(nèi)的行走得分與垂直得分(行走得分：大鼠3只爪子進(jìn)入1個(gè)格子計(jì)1分；垂直得分：大鼠前爪離地或攀附桶壁1次計(jì)1分)。曠場試驗(yàn)固定在18：00～19：00時(shí)進(jìn)行，安靜黑暗環(huán)境，并每次都清理大鼠排泄物，去除可能留下的味道。每只大鼠造模前與造模后共進(jìn)行2次曠場試驗(yàn)。

4.腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核組織的取材：抑郁行為學(xué)指標(biāo)測定后，在大鼠麻醉后，頭部固定于定向儀上。頭頸部剪毛、消毒，用手術(shù)刀沿縱軸切一縱行切口(約2cm)用剪刀鈍性分離頸部背側(cè)肌肉。為避免出血， 最深層附著在骨上的肌肉用手術(shù)刀背刮開，暴露出枕骨大孔，由枕骨大孔進(jìn)針直接抽取腦脊液。斷頭處死大鼠，按包新民等的大鼠腦立體定位圖譜，在冰上迅速分離前額葉皮質(zhì)、海馬和中縫核[9]。

5.Western blot法測定SERT蛋白：使用真核膜蛋白提取試劑盒Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit(Thermo Fisher Scientific公司, 美國)提取前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核組織的膜蛋白，并且通過Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。Western blot法測定SERT蛋白的步驟按照Huff等[10]的文章進(jìn)行。抗SERT一抗 (1∶250稀釋)，抗β-actin一抗(1∶250稀釋)以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)購自加拿大Santa Cruz公司。使用ChemiDocTM XRS+ (Bio-rad美國)系統(tǒng)自帶的軟件分析SERT蛋白條帶，并用β-actin進(jìn)行校正。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定miR-16：通過miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取腦脊液、前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核總RNA，用nanodrop(美國thermo scientific公司)測定其濃度及純度；取2μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用于下一步的實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增。U6為內(nèi)參校準(zhǔn)基因，引物序列：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-3′，miR-16引物序列：5′-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3′。下游引物為通用引物[北京天根生化科技有限公司miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)自帶]。實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 2min；PCR反應(yīng)：94℃ 20s，60℃ 34s，循環(huán)40次,實(shí)時(shí)PCR儀購自ABI公司stepone plus，使用儀器配套軟件自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到每個(gè)樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得每個(gè)樣本的miR-16含量，所得數(shù)據(jù)用對(duì)應(yīng)的U6進(jìn)行校正。

結(jié) 果

1.抑郁行為學(xué)指標(biāo)結(jié)果:造模前，模型組的糖水消耗率、曠場實(shí)驗(yàn)水平得分和垂直得分分別與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.872、0.835和0.602)；造模后，抑郁模型組大鼠糖水偏好率顯著低于對(duì)照組(P=0.032)，曠場實(shí)驗(yàn)水平得分和垂直得分都明顯低于對(duì)照組(P=0.042和P=0.000，表1)。

表1 兩組大鼠糖水消耗實(shí)驗(yàn)以及曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ±s)

2.腦脊液、海馬、前額葉皮質(zhì)、中縫核miR-16測定結(jié)果:模型組腦脊液中的miR-16相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.049，P=0.007)；海馬中miR-16相對(duì)量在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.169，P=0.868)。前額葉皮質(zhì)miR-16的相對(duì)表達(dá)量，模型組與對(duì)照組之間的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.280，P=0.782)。中縫核miR-16的相對(duì)表達(dá)量，模型組顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.333，P=0.031，表2，圖1)。

表2 腦組織不同部位miR-16測定結(jié)果

圖1 腦脊液和中縫核miR-16熒光定量PCR測定結(jié)果A.腦脊液；B.海馬；C.前額葉皮質(zhì)；D.中縫核

3.海馬、前額葉皮質(zhì)、中縫核SERT蛋白測定結(jié)果:SERT蛋白的水平，海馬組織中，模型組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.243，P=0.811)；前額葉皮質(zhì)中，模型組與對(duì)照組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.762，P=0.456)。中縫核中，模型組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.184，P=0.005，圖2和表3)。

4.中縫核miR-16與SERT蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性:經(jīng)相關(guān)分析，對(duì)照組和模型組中縫核miR-16與相應(yīng)的SERT蛋白之間均存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。對(duì)照組的相關(guān)系數(shù)為r=-0.662，P=0.037； 模型組的相關(guān)系數(shù)為r=-0.701，P=0.024，詳見圖3。

圖2 不同腦區(qū)SERT蛋白Western blot法檢測結(jié)果

表3 不同腦區(qū)SERT蛋白測定結(jié)果

圖3 中縫核miR-16與SERT蛋白的相關(guān)性A.對(duì)照組；B.模型組

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過建立慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激大鼠抑郁模型，研究大鼠神經(jīng)系統(tǒng)不同部位miR-16表達(dá)及其與SERT的關(guān)聯(lián)性，從而進(jìn)一步明確miR-16在何部位參與抑郁癥的病理生理過程。在脊椎動(dòng)物體內(nèi)，腦組織中的miRNAs遠(yuǎn)比其他組織豐富，提示miRNAs可能在腦功能的發(fā)揮中起著重要作用[11, 12]。有研究者發(fā)現(xiàn)，腦脊液中的miRNAs可能與精神疾病相關(guān)。比如2014年，Muller等[13]的研究表明，阿爾茨海默病患者腦脊液中的miR-146a比健康人低。但是迄今為止，尚未有抑郁癥腦脊液miR-16水平的報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)采集了抑郁模型大鼠的腦脊液，進(jìn)行miR-16測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其水平比對(duì)照組大鼠低。該結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)，以確定腦脊液miR-16作為抑郁癥生物學(xué)標(biāo)志物的可行性。

本研究還對(duì)腦組織前額葉皮質(zhì)、海馬、中縫核中的miR-16進(jìn)行了測定。有研究者發(fā)現(xiàn)，抑郁癥自殺患者前額葉皮質(zhì)中的某些miRNAs存在異常，如miR-494和miR-335比健康對(duì)照低[14]。但是，目前尚未發(fā)現(xiàn)抑郁癥前額葉皮質(zhì)miR-16的報(bào)道，本次抑郁模型大鼠的前額葉皮質(zhì)miR-16水平測定結(jié)果表明，模型組大鼠前額葉皮質(zhì)miR-16水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且該部位SERT蛋白的表達(dá)亦與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明，前額葉皮質(zhì)miR-16可能不參與抑郁癥的病理過程。

近年來，海馬miR-16與抑郁癥的研究得到了一些研究者的關(guān)注。如張逸等[15]在母愛剝奪大鼠抑郁模型中，發(fā)現(xiàn)海馬miR-16比正常大鼠高，作者認(rèn)為，海馬高miR-16參與了母愛剝奪誘發(fā)的大鼠抑郁樣行為的病理過程。在另外的一項(xiàng)研究中，抗抑郁藥氟西汀能降低小鼠海馬組織miR-16，如果使用人工合成的抗miR-16對(duì)miR-16進(jìn)行中和，則抗miR-16表現(xiàn)出抗抑郁樣作用[16]。但是在Bai等的研究中，作者采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激建立抑郁模型，未發(fā)現(xiàn)模型大鼠的海馬miR-16發(fā)生改變。基于海馬miR-16在不同抑郁模型結(jié)果中的不一致性，以及Bai等[17]未比較海馬SERT蛋白的差異，因此本實(shí)驗(yàn)在測定模型大鼠海馬miR-16的同時(shí)，也分析了海馬SERT的差異，結(jié)果表明，模型大鼠海馬miR-16并未升高，該結(jié)論與Bai等[17]發(fā)表的論文一致，而且該部位SERT蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較，亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，海馬miR-16未參與和慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁相關(guān)的病理過程，提示不同的應(yīng)激所誘發(fā)的大鼠抑郁行為，其機(jī)制可能不同。

中縫核因聚集5-HT能神經(jīng)元，其主要功能是產(chǎn)生遞質(zhì)5-HT，因而在miR-16與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究中具有重要意義。Baudry 等將氟西汀(1μmol/L、2μl/min)直接緩慢注入中縫核3天，發(fā)現(xiàn)該區(qū)miR-16升高了2.5倍，SERT的表達(dá)降低了2倍；直接在該區(qū)注射miR-16(1μl、2μmol/L)也觀察到SERT表達(dá)的下降；然而，當(dāng)氟西汀和抗miR-16一起注射的時(shí)候，SERT表達(dá)未受影響，由此可見，氟西汀是通過miR-16調(diào)節(jié)SERT蛋白的表達(dá)[7]。然而，在抑郁動(dòng)物模型中，中縫核miR-16與對(duì)照的差異卻未被報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)表明，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠中縫核miR-16低于對(duì)照組，其SERT蛋白水平卻高于對(duì)照組，且兩者間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。筆者認(rèn)為，中縫核低miR-16狀態(tài)，可導(dǎo)致SERT蛋白過高表達(dá)，從而影響5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)的功能，從而參與慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激造成的抑郁過程。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過測定神經(jīng)系統(tǒng)不同部位miR-16水平，探討miR-16參與抑郁癥的可能部位及其機(jī)制。結(jié)果表明，慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠腦脊液和中縫核miR-16存在異常，中縫核miR-16可能通過調(diào)節(jié)SERT蛋白表達(dá)而參與抑郁癥的發(fā)病過程。

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(修回日期：2015-02-23)

miR-16 Expression and Its Association with Serotonin Transporter in Multi-tissues of Depression Model Rats.

SongMingfen,WangYuwen,DongJiezheng,etal.

DepartmentofMolecularBiologicalLaboratory,HangzhouSeventhPeople′sHospital,Zhejiang310013,China

Objective To explore the expression of miR-16 and its association with serotonin transporter in multi-tissues from the rat model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Methods SD rats were randomly divided into the control group and the depression group. Rats in the depression group experienced unpredictable mild stressors for 3 weeks, while rats in the control group

no treatment. MiR-16 in cerebrospinal fluid, prefrontal cortex, hippocampus, and raphe was detected by real-time PCR. Serotonin transporter protein in prefrontal cortex, hippocampus, and raphe was detected by Western blotting. Results The relative expression levels of miR-16 in cerebrospinal fluid and raphe of the depression group were significantly lower than those of the control group. In raphe, the miR-16 level was negatively associated with expression of serotonin transporter protein. However, there was no significant difference of miR-16 expression in prefrontal cortex and hippocampus between the depression group and the control group. Conclusion MiR-16 in raphe may involve in the pathological process of depression via regulation of serotonin transporter expression. MiR-16 in cerebrospinal fluid may also associate with depression.

chronic unpredictable mild stress model of depression; miR-16; 5-HT serotonin transporter

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ13H090003)；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)?？茖２】蒲泄リP(guān)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(20130733Q26，20130733Q27)

310013 杭州市第七人民醫(yī)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(宋明芬、章隆)，藥劑科(王玉文)，精神科(董介正、施劍飛、張永華)

張永華，主任中醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，電子信箱: hzs7lwfb@163.com

R74

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.012

2015-01-28)