范悅，吳曉光，繆紅，程建軍，商亞珍

(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室/承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000)

·藥物研究·

半枝蓮黃酮對β-淀粉樣蛋白所致星形膠質細胞損傷的影響*

范悅，吳曉光，繆紅，程建軍，商亞珍

(河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室/承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000)

目的 探討半枝蓮黃酮(SBF)對β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)損傷星形膠質細胞的干預作用。方法 培養(yǎng)第3代星形膠質細胞分為空白對照組，模型對照組和半枝蓮黃酮小、中、大劑量組。半枝蓮黃酮小、中、大劑量組細胞分別給予17.5，35.0和70.0 μg·mL-1半枝蓮黃酮作用24 h后，模型對照組和半枝蓮黃酮小、中、大劑量組細胞再分別加入終濃度Aβ25-35100 μmol·L-1繼續(xù)作用24 h。噻唑藍(MTT)比色法測定細胞存活率，分光光度法測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量，免疫組織化學方法測定細胞內LDH的合成量，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定培養(yǎng)液中細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的水平。結果 與空白對照組比較，模型對照組細胞存活率降低49.94%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組細胞存活率分別提高12.50%(P<0.05)，16.67%(P<0.01)和2.08%(P>0.05)。與空白對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)上清液中LDH減少36.65%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組LDH分別增加11.35%(P>0.05)，26.40%(P<0.01)和32.44%(P<0.01)。與空白對照組比較，模型對照組星形膠質細胞LDH蛋白表達的陽性面積比例降低24.92%(P<0.05)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮中和大劑量組LDH蛋白表達的陽性面積比例分別提高31.20%和53.60%。與空白對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6水平分別降低23.60%和15.47%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組IL-1β釋放量分別增加5.74%(P>0.05)，24.82%(P<0.01)和6.86%(P>0.05)；IL-6釋放量分別增加11.30%(P<0.05)，17.39%(P<0.01)和3.87%(P>0.05)。結論 半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的星形膠質細胞損傷具有保護作用，這可能有利于闡述半枝蓮黃酮治療阿爾茨海默病的作用機制。

半枝蓮黃酮；阿爾茨海默??；星形膠質細胞；β-淀粉樣蛋白

老年癡呆分為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆和混合性癡呆等，其中AD是知曉最多，也是較為普遍的一種老年癡呆癥。研究發(fā)現(xiàn)，腦內出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)聚集而形成的老年斑(senile plaque，SP)和tau蛋白過度磷酸化而產生的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)是AD的特征性病理改變，而神經膠質細胞結構和功能的異常變化也與AD病理過程密切相關。神經膠質細胞是神經組織中除神經元以外的另一大類細胞，其中星形膠質細胞數(shù)量最多，在神經退行性疾病中承擔重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ由39～43個氨基酸殘基組成，Aβ25-35是其主要毒性片段，對體外培養(yǎng)細胞及體內神經細胞均具有毒性作用[1]。而對膠質細胞的影響則隨著研究進展越來越受到重視。因此，任何抑制星形膠質細胞異常變化都有利于神經退行性疾病的治療。半枝蓮(ScutellariabarbataD.Don) 為唇形科黃芩屬植物，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫、鎮(zhèn)痛等功效。半枝蓮黃酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是從半枝蓮中提取分離的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化和改善記憶障礙等多種藥理作用[2-5]。其主要成分是野黃芩苷屬黃酮類化合物，其多羥基結構具有較強還原性，對神經有保護作用，但對膠質細胞的影響筆者未見報道，筆者在本研究利用Aβ25-35損傷星形膠質細胞體外模型，探討半枝蓮黃酮通過對膠質細胞的影響發(fā)揮抗癡呆作用。

1 材料與方法

1.1 動物 新生1～3 d的斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠(合格證編號：90912)，雌雄不限，河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(冀)2009-0111。

1.2 試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液(Gibco公司，批號：8112389)，胎牛血清(PAA公司，批號：715396)，胰蛋白酶、噻唑藍(Methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide，MTT，華美生物工程有限公司，批號：BS0887)，二抗試劑盒(批號：120516)、DAB顯色試劑盒(批號：12196A08)購自武漢博士德生物工程有限公司，Aβ25-35(上海強耀生物科技有限公司，批號：20121205)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(中生北控科技股份有限公司，批號：120441)，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自上海索寶生物試劑公司，批號：201206，半枝蓮黃酮由承德醫(yī)學院中藥研究所提供，紫外分光光度法測定，純度為93.1%。

1.3 星形膠質細胞的培養(yǎng) 取SD大鼠雙側大腦皮質，剔除腦膜及血管，剪碎呈糊狀，加入0.125%胰蛋白酶置于37 ℃、二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中消化30 min，20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。離心，以5×104個·(cm2)-1接種于用0.1%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。30 min后輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)3 d換液一次，培養(yǎng)約10 d細胞長滿瓶底進行傳代。傳代第3代細胞利用免疫組化法對星形膠質細胞內特異性蛋白——星形膠質細胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)進行細胞鑒定，結果發(fā)現(xiàn)傳代第3代 95%細胞為星形膠質細胞。

1.4 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的配制 將Aβ25-35溶于三蒸水中過濾除菌，再與培養(yǎng)液混合配成200 μmol·L-1貯備液，分裝-20 ℃保存，使用前需置37 ℃溫箱孵育5～7 d以形成有神經毒性的聚集性Aβ25-35。半枝蓮黃酮溶于培養(yǎng)液中，配成100 μg·mL-1貯備液，濾過除菌，分裝，4 ℃保存。

1.5 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的作用 3代以上的細胞接種于96孔板內，每孔5×104個，每孔200 μL，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，分為空白對照組，模型對照組，半枝蓮小、中、大劑量組，每組8孔，每孔均設置復孔。3個濃度藥物組細胞培養(yǎng)液加藥物終濃度為17.5，35.0和70.0 μg·mL-1，空白對照組和模型對照組細胞給予無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。隨后除空白對照組加無血清培養(yǎng)液外，其余各組再加Aβ25-35使其終濃度為100 μmol·L-1，再培養(yǎng)24 h。

1.6 細胞存活率的測定 接種于96孔板的星形膠質細胞經半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，每孔加入MTT溶液200 μL，終濃度為0.5 mg·mL-1，培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，每孔100 μL，待藍紫色甲瓚結晶溶解后，酶標儀測定570 nm波長處的吸光度值(A)。

1.7 LDH測定

1.7.1 分光光度法測定培養(yǎng)液中LDH釋放量 接種于96孔板的星形膠質細胞經半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，每孔加無血清培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)24 h，吸出，分光光度法測定培養(yǎng)液中LDH釋放量。

1.7.2 免疫組化法測定星形膠質細胞中LDH的蛋白表達 培養(yǎng)第3代的星形膠質細胞制作爬片細胞，48 h后半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，進行LDH蛋白表達的免疫組化測定，同時用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)代替一抗作陰性對照。

1.8 IL-1β和IL-6的測定 接種于96孔板的星形膠質細胞經半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，每孔加無血清培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)24 h，吸出，4 ℃離心，小心吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 半枝蓮黃酮對細胞存活率的影響 與空白對照組比較，模型對照組細胞存活率降低49.94%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮3個濃度組細胞存活率不同程度提高，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組細胞存活率分別提高12.50%(P<0.05)，16.67%(P<0.01)和2.08%(P>0.05)(表1) 。

表1 5組Aβ25-35損傷星形膠質細胞存活率

F=190.039，與空白對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

F=190.039，Compared with blank control group,*1P<0.01; compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.2 半枝蓮黃酮對星形膠質細胞LDH的影響

2.2.1 半枝蓮黃酮對星形膠質細胞培養(yǎng)上清液中LDH的影響 空白對照組LDH釋放量為(67.99±5.19)，模型對照組為(43.07±7.23)，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組分別為(47.96±5.46)，(54.44±5.91)，(57.04±4.05)，與空白對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)上清液中LDH明顯減少36.65%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組培養(yǎng)上清液中LDH的量分別增加11.35%(P>0.05)，26.40%(P<0.01)和32.44%(P<0.01)。

2.2.2 半枝蓮黃酮對星形膠質細胞內LDH蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組星形膠質細胞內棕色顆粒數(shù)量明顯減少，顏色變淺，特別是纖維型星形膠質細胞表現(xiàn)更為明顯，陽性細胞數(shù)量也明顯減少。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小劑量組沒有明顯改變，半枝蓮黃酮中和大劑量組星形膠質細胞棕黃色顆粒變多變深，且陽性細胞數(shù)目明顯增加(圖1)。LDH蛋白表達的陽性面積比例測試也顯示出同樣的趨勢?？瞻讓φ战MLDH表達為(3.33±0.05)，模型對照組為(2.50±0.15)，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組分別為(2.51±0.20)，(3.28±0.04)，(3.84±0.76)。與空白對照組比較，模型對照組星形膠質細胞LDH蛋白表達的陽性面積比例降低24.92%(P<0.05)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組不同程度提高LDH蛋白陽性面積比例，其中半枝蓮黃酮小劑量組沒有明顯改變，半枝蓮黃酮中和大劑量組LDH蛋白表達的陽性面積比例分別提高31.20%和53.60%(P<0.05)。

2.3 半枝蓮黃酮對星形膠質細胞IL-1β和IL-6釋放的影響 與空白對照組比較，模型對照組細胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6水平，分別降低了23.60%和15.47%(P<0.01)。與模型對照組比較，半枝蓮黃酮小、中和大劑量組不同程度提高IL-1β和IL-6的含量，其中 IL-1β釋放量分別增加5.74%(P>0.05)，24.82%(P<0.01)和6.86%(P>0.05)；IL-6釋放量分別增加11.30%(P<0.05)，17.39%(P<0.01)和3.87%(P>0.05)(表2)。

3 討論

隨著老齡化社會的到來，AD發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害人類健康，給社會和家庭都帶來巨大的經濟負擔。一系列研究表明，Aβ25-35是誘發(fā)AD發(fā)生和發(fā)展的主要因素之一，Aβ25-35的出現(xiàn)早于NFT、軸索缺乏營養(yǎng)等病理變化以及臨床表現(xiàn)。Aβ25-35的神經毒性涉及到復雜的分子機制，主要包括促進自由基的形成、破壞細胞內鈣離子(Ca2+)穩(wěn)態(tài)，降低鉀離子(K+)通道功能，增強致炎因子等引起的炎癥反應[6-7]。

A.空白對照組；B.模型對照組；C.半枝蓮黃酮小劑量組；D.半枝蓮黃酮中劑量組；E.半枝蓮黃酮大劑量組

A.blank control group; B.model control group; C.low-dose SBF group; D.medium-dose SBF group;E.high-dose SBF group

Fig.1 Effect of SBF on LDH expression in Aβ25-35-injured astrocytes(DAB staining，×200)

表2 5組Aβ25-35損傷星形膠質細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6測定值

IL-1β，F(xiàn)=20.431；IL-6，F(xiàn)=7.281；與空白對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01

IL-1β，F(xiàn)=20.431；IL-6，F(xiàn)=7.281；Compared with blank control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

星形膠質細胞是神經膠質細胞中數(shù)量最多的一種，除了以往認識的在神經系統(tǒng)中有支持營養(yǎng)作用外，與神經元之間還存在復雜的相互作用，也與許多神經退行性疾病有密切聯(lián)系。傳統(tǒng)觀點認為，Aβ主要是由神經元產生的，但新近研究表明，星形膠質細胞，特別是在激活狀態(tài)下的星形膠質細胞也可以產生Aβ[8]，同時星形膠質細胞可對細胞外Aβ進行內化和攝取[9]，進而降解和清除細胞內外的Aβ[10]，而產生的Aβ反過來又可以激活星形膠質細胞[11]。許多實驗證實，不同Aβ衍生物，尤其在它們聚集狀態(tài)時，對神經細胞具有毒性作用[12]。因此筆者在本實驗使用經過老化處理的成為聚集狀態(tài)的Aβ25-35，進行損傷星形膠質細胞。LDH 廣泛存在于組織細胞內，正常細胞幾乎不釋放LDH，其釋放量的多少可反映細胞膜的完整性，因此LDH 活性增加為細胞損傷的重要標志之一[13]。但本實驗發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型對照組細胞LDH釋放量減少，與一般文獻描述不同，故進行LDH免疫組化，結果證實100 μmol·L-1Aβ25-35能使星形膠質細胞內LDH合成量減少，這就解釋釋放量減少的原因，而細胞存活率降低就進一步導致培養(yǎng)上清液中LDH的量減少。半枝蓮黃酮給藥組不同程度地提高了細胞存活率，細胞內LDH的量也逐步增加，釋放到細胞外的LDH也相應增多。

神經炎癥是AD的特征表現(xiàn)之一，炎癥是由星形膠質細胞和小膠質細胞釋放的炎性因子介導的，這些因子參與免疫應答，誘導炎癥的發(fā)生，而炎癥因子在AD發(fā)病早期起著至關重要的作用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應對AD是一把雙刃劍，首先它作為一種自身保護機制可以清除刺激物，修復組織，在精密調控下的炎癥反應可以去除組織細胞碎片、有害蛋白質和受損神經元釋放的毒性物質，還可殺滅入侵的病原體，阻止腦內感染和損傷的擴散[16-17]，并通過分泌神經營養(yǎng)因子如膠質源性神經生長因子(glia-derived neurotrophic factor，GDNF)等以促進神經元的修復[18]，這些作用均有利于受損神經元的存活及功能恢復，從而發(fā)揮神經保護作用。然而持續(xù)的炎癥反應對機體有害，該過程中產生的炎性因子和抗炎因子會加劇Aβ25-35的產生，加速神經元的損傷，誘發(fā)AD[19]。IL-1 β可能是AD發(fā)展和演進早期病理因子，大量資料已經證實IL-1 β可以促使AD tau 蛋白病變的形成和發(fā)展，AD患者腦內 IL-1β表達水平和 tau 蛋白病變有著密切的相關性[20]。TAN等[21]用 Aβ25-35處理培養(yǎng)的海馬神經元及人胎腦細胞，神經元最終死亡，膠質細胞增生，IL-1、 IL-6、 TNF-α等細胞因子釋放增加。然而IL-1β和IL-6不僅是炎性因子，在神經系統(tǒng)更是作為細胞因子，由于本實驗高濃度(100 μmol·L-1)Aβ25-35引起星形膠質細胞不是增生，而是數(shù)量減少，存活率降低，合成細胞因子減少，釋放到胞外的量也減少，半枝蓮黃酮組能不同程度地逆轉這種減少趨勢。本實驗體外培養(yǎng)的為正常生理狀態(tài)下的星形膠質細胞，并非在病理狀態(tài)下異?；罨錾男切文z質細胞，故在Aβ25-35損傷情況下引起的是細胞數(shù)量減少而非增生，各項指標也出現(xiàn)了與某些報道不一致的情況。

半枝蓮含有多種化學成分，主要有效成分為黃酮類化合物，其中含量最多的也是野黃芩苷，具有抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等功效，但除了黃酮類成分，還含有生物堿、酚類和鞣質等，本實驗半枝蓮黃酮大劑量組的保護作用出現(xiàn)降低，推測為半枝蓮中雜質的毒性作用，如鞣質等，這也正是中藥成分多、藥理作用復雜的體現(xiàn)。綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)半枝蓮黃酮在一定濃度范圍內對Aβ25-35引起的損傷細胞具有保護作用。

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Effect ofScutellariaBarbataFlavonoids on β-Amyloid Protein-induced Injury in Rats Astrocytes

FAN Yue, WU Xiaoguang, MIAO Hong, CHENG Jianjun, SHANG Yazhen

(HebeiProvincialKeyResearchOfficeofTraditionalChineseMedicineAgainstDementia,InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objective To study the effects of flavonoids fromScutellariaBarbataon β-amyloid protein 25-35 (Aβ25-35)-induced injury of rats’ astrocytes. Methods Rats’ astrocytes of passage 3 were divided into blank control group, model control group, small, middle and large doses (17.5, 35.0 and 70.0 μg·mL-1, respectively) ofScutellariaBarbataflavonoids groups.After treatment by 17.5, 35.0 and 70.0 μg·mL-1ofScutellariaBarbataflavonoids for 24 h, the cells of model control, small, middle and large dose groups were added with Aβ25-35(final concentration: 100 μmol·L-1) and cultured for another 24 h.MTT colorimetric method was used to measure cell viability, spectrophotometry to determine LDH content in cultured medium, immunohistochemistry to detect cellular LDH, ELISA to detect IL-1β and IL-6 levels in culture medium. Results As compared with blank control group, cell survival rate of model control group was significantly decreased by 49.94% (P<0.01).As compared with model control group, cell survival rate was increased by 12.50% (P<0.05), 16.67% (P<0.01) and 2.08% (P>0.05) in small, medium and large dose groups, respectively.As compared with blank control group, LDH of supernatant fluid was significantly decreased by 36.65% (P<0.01).As compared with model control group, LDH level was increased by 11.35% (P>0.05), 26.40% (P<0.01) and 32.44% (P<0.01) in the small, medium and large dose groups.As compared with blank control group, positive area proportion of LDH protein in astrocytes was decreased by 24.92% (P<0.05).As compared with model control group, positive area proportion of LDH protein was increased by 31.20% and 53.60% in medium and large dose groups, respectively.As compared with blank control group, IL-1β and IL-6 were significantly decreased in the model control group by 23.60% and 15.47% (P<0.01), respectively.As compared with model control group, IL-1β and IL-6 were increased in small, medium and large dose groups, and IL-1β was increased by 5.74% (P>0.05), 24.82% (P<0.01) and 6.86% (P>0.05), respectively; IL-6 was increased by 11.30% (P<0.05), 17.39% (P<0.01) and 3.87% (P>0.05), respectively. ConclusionScutellariaBarbatafalvonoids exert protective effect on Aβ25-35-induced astrocyte injury.ScutellariaBarbataflavonoids might treat Alzheimer’s disease through influencing astrocytes.

ScutellariaBarbataflavonoids; Alzheimer’s disease; Astrocytes; β-Amyloid protein

2014-01-20

2014-06-03

*河北省自然科學基金(C2009001007，H2014406048)；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目(05027)；河北省高等學校重點學科資助項目。

范悅(1987-)，女，河北邯鄲人，碩士，研究方向：中藥神經藥理學。電話：(0)18810958701，E-mail： 616745565@qq.com。

商亞珍(1963-)，女，滿族，河北承德人，研究員，教授，博士，從事中藥神經藥理研究。電話：0314-2290616，E-mail：shangyz1018@sina.com。

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1004-0781(2015)02-0141-05