夏敬勝，蔡瑜

(武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060)

葛根川芎藥對中葛根素和阿魏酸的大鼠在體腸吸收機(jī)制

夏敬勝，蔡瑜

(武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430060)

目的 探討葛根川芎藥對中指標(biāo)性成分葛根素、阿魏酸在體腸吸收機(jī)制，為其復(fù)方的研發(fā)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 采用大鼠在體腸單向灌流法，高效液相色譜(HPLC)法測定葛根素、阿魏酸2種成分含量，考察葛根-川芎藥對提取物三種人工腸液緩沖液濃度、灌流時間及大鼠十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸對其吸收的影響。 結(jié)果 高、中、低濃度葛根-川芎藥對中葛根素和阿魏酸的全腸段吸收速率常數(shù)(Ka)均約0.01 min-1；兩種成分的全腸段表觀吸收系數(shù)(Papp)均在0.03～0.05 cm·min-1，濃度對葛根素、阿魏酸腸吸收情況影響不大。葛根素在不同腸段的Ka及Papp不同，Ka值在十二指腸最大為(0.099 0±0.002 7) min-1，Papp值在空腸最大為(0.014 0±0.001 2 )cm·min-1；阿魏酸Ka值在十二指腸最大為(0.180±0.036)min-1，Papp值在空腸最大(0.037±0.015)cm·min-1。葛根素的Ka和Papp隨時間影響很小，而阿魏酸Ka和Papp都隨時間影響變化較大。結(jié)論 葛根川芎藥對中指標(biāo)性成分葛根素、阿魏酸屬于被動吸收。

葛根素；阿魏酸；藥對；吸收，腸，在體

中藥藥動學(xué)研究方法多效仿西藥研究模式，從中藥材中分離目標(biāo)成分后，采用生物醫(yī)學(xué)方法研究其吸收、分布、代謝、排泄規(guī)律[1]。藥物被吸收是發(fā)揮藥效的首要環(huán)節(jié)，藥物吸收的研究是評價藥物生物利用度的重要手段，可為藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)化研究提供基礎(chǔ)?？诜幬锏奈?，取決于藥物本身的理化性質(zhì)、小腸上皮細(xì)胞的通透作用、腸黏膜構(gòu)造、腸內(nèi)酶及腸上皮細(xì)胞對藥物代謝的屏障作用。研究腸吸收機(jī)制，可以獲得藥物在腸道的吸收動力學(xué)參數(shù)、有效吸收部位、吸收機(jī)制、影響因素等信息，從而為提高藥物生物利用度提供參考。

在體腸灌流模型的原理是假定藥物的減少等于藥物的吸收，通過測定灌流液中藥物減少量來評價藥物的小腸吸收情況，測定吸收速率及吸收量等，計算藥物的吸收動力學(xué)參數(shù)，如藥物吸收速率常數(shù)(Ka)、表觀吸收系數(shù)(Papp)等，能在一定程度上反映藥物的滲透和吸收動力學(xué)特征?？捎糜谘芯恐兴巻误w成分、復(fù)方提取物及中藥制劑指標(biāo)性成分的腸吸收機(jī)制，考察胃腸吸收的最適pH和最佳吸收部位[2-4]。

葛根川芎配伍(1.2：1)藥對能顯著改善腦缺血、眩暈等癥狀[5-6]，主要用于治療頸椎病[7]，其藥動學(xué)研究筆者未見報道。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用大鼠在體腸單向灌流法，用高效液相色譜(HPLC)法測定葛根川芎藥對中指標(biāo)性成分葛根素、阿魏酸含量，考察不同藥物濃度、灌流時間、不同腸段對其吸收的影響。探討葛根川芎藥對中2種指標(biāo)性成分的在體腸吸收機(jī)制，以期為這一藥對在復(fù)方配伍及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自廣東省動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2014-0035，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，動物質(zhì)量合格證號：44008200003485，動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0085。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201012，純度：97%)；葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912，純度：98%)；人工腸液(Kreb-Ringer's，KR)緩沖液[8](氯化鈣 0.37 g·L-1，葡萄糖1.4 g·L-1，氯化鈉7.8 g·L-1，氯化鈣0.35 g·L-1，碳酸氫鈉1.37 g·L-1，磷酸二氫鈉0.32 g·L-1，氯化鎂0.02 g·L-1)；乙腈(HPLC級，Honeywell Burdick & Jackson，批號：M44A1H)；甲醇(HPLC級，Honeywell Burdick & Jackson，批號：N5AG1H)；水為純化水；其余試劑均為分析純；葛根(產(chǎn)地：廣西，批號：110510)、川芎(產(chǎn)地：四川，批號：110510)藥材均購自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部陳永剛副教授鑒定為合格藥材，均符合《中華人民共和國藥典》2010年版相關(guān)藥材項檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，飲片標(biāo)本保存于武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部標(biāo)本室。

1.3 儀器 戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀(包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon工作站)；AR224CN電子天平[d=0.000 1 g，奧豪斯儀器(上海)公司]；SK3300LH超聲儀(托利多儀器上海有限公司)；IKA RV10 HB10 basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA)；HHS-4S水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.4 色譜條件 色譜柱：戴安公司Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：250 nm，柱溫30 ℃。

表1 甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫程序%

1.5 對照品溶液的配制 分別取阿魏酸、葛根素對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別得濃度為22 μg·mL-1阿魏酸、27 μg·mL-1葛根素對照品溶液。

1.6 樣品溶液的制備 按12：10取葛根、川芎藥材1份，加10倍量65%乙醇，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，至95 ℃烘箱中干燥至干，取出，置于干燥器中冷卻，打成細(xì)粉，備用。取上述葛根川芎藥對提取物粉末約25.0，12.5，6.25 g，精密稱定，置500 mL量瓶，用KR緩沖液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，配成高(50 mg·mL-1)、中(25 mg·mL-1)、低(12.5 mg·mL-1)3種濃度。

1.7 大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)方法 參照文獻(xiàn)[2]。將大鼠禁食過夜(自由飲水)，用3 mg·mL-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg·kg-1)，固定。置40 ℃水浴鍋上保持體溫。沿腹腔中線打開腹腔，分離出所需腸段，于切口處插管(進(jìn)、出液口插管約3 cm)，結(jié)扎。用預(yù)熱的37 ℃KR緩沖液以150 r·min-1[r為灌流腸段橫截面半徑(cm)]恒定流速將小腸內(nèi)容物沖洗干凈，再平衡10 min，排凈空氣，將傷口用脫脂棉覆蓋保濕，各組灌流液保持37 ℃恒溫，以150 r·min-1速度平衡10 min后，記為0 min時，以后葛根-川芎湯灌流液以100 r·min-1的流速灌流120 min。分別于20，40，60，80，100，120 min用已知質(zhì)量的離心管收集灌流液，稱定質(zhì)量，再于各管中取灌流液1 mL，加入甲醇1 mL沉淀蛋白，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即為樣品溶液，分別吸取對照品溶液、樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定各時間點(diǎn)各成分的吸收峰面積。用上述實(shí)驗(yàn)方法分別考察高、中、低濃度及各腸段對各成分在體腸吸收的影響規(guī)律。

1.8 不同濃度藥物在全腸段吸收情況考察 參照文獻(xiàn)[2]，考察樣品在大鼠十二指腸、空腸、回腸以及結(jié)腸中的吸收情況。觀察腸段取約10 cm，各腸段區(qū)間如下：十二指腸段，自幽門1 cm處開始往下10 cm；空腸，自幽門15 cm處起往下10 cm；回腸，自盲腸上行20 cm處開始往下10 cm；結(jié)腸，從盲腸后端開始往下10 cm。不同腸段分別用同一濃度藥物的灌流液進(jìn)行灌流，其他步驟同“1.7” 項，計算樣品在各腸段的Ka與Papp，比較藥物在不同腸段吸收情況差異[2]。

Qin和Qout分別為腸道進(jìn)出口灌流液的體積(mL)(假定進(jìn)出口灌流液密度為110 g·mL-1)，Cin和Cout分別為腸道進(jìn)出口灌流液的濃度(未知成分按峰面積計算)，l和r分別為被灌流腸段長度(cm) 和橫截面半徑(cm)，Q為灌流速度，t為灌流時間。Ka和Papp為各個時間段樣品的平均值。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 阿魏酸在8.80～880 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.018 6X+0.000 5，r=0.999 9；葛根素在1.08 ～108 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.023 6X+ 0.000 6，r=0.999 9。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取葛根素、阿魏酸對照品溶液40 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄葛根素、阿魏酸色譜峰峰面積，計算峰面積積分值RSD值。結(jié)果葛根素、阿魏酸RSD分別為0.40%，0.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取高濃度葛根-川芎-KR樣品溶液分別于0，12，20，32，40，48 h進(jìn)樣15 μL分析，測定葛根素和阿魏酸峰面積，計算RSD值。結(jié)果葛根素、阿魏酸峰面積積分值RSD分別為1.1%，1.3%(n=6)，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取葛根川芎粉末6份，精密稱定，按樣品制備方法，制備成高濃度樣品溶液，按上述色譜條件，進(jìn)樣15 μL分析，記錄葛根素和阿魏酸色譜峰峰面積，計算葛根素和阿魏酸的峰面積積分值RSD值。結(jié)果RSD分別為3.6%，2.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 濃度對藥物吸收的影響 實(shí)驗(yàn)分高、中、低組，每組4只大鼠，雌雄各半，按“1.8” 項方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取葛根素、阿魏酸，研究其腸道吸收情況。結(jié)果見表2,3。

2.6 不同腸段對藥物吸收的效果 實(shí)驗(yàn)選用中濃度樣品溶液按“1.8”項下方法對大鼠4個腸段分別進(jìn)行灌腸，檢測葛根素和阿魏酸的吸收情況。其中每個腸段用大鼠4只，雌雄各半。結(jié)果見表4。不同時段各成分吸收情況見圖1和圖2。

2.7 不同時段各成分吸收情況 不同時段葛根素和阿魏酸Ka和Papp變化趨勢見圖1，2。

表2 不同濃度動物凈水流量

3 討論

目前關(guān)于中藥有效成分小腸吸收研究，黃酮類和生物堿類成分最多，醌類、萜類和苯丙素類均有研究[9]。改變口服給藥劑型，可以制成脂質(zhì)體，可增加親水性中藥成分的腸道吸收；或者添加促吸收劑，如葵酸鈉、冰片，也可以促進(jìn)腸道的吸收[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛根素和阿魏酸在全腸段均有吸收。用濃度或峰面積計算葛根素和阿魏酸的Ka及Papp值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從3種濃度灌流液對大鼠全腸段進(jìn)行的灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，藥物濃度對各成分吸收參數(shù)的影響不大，全腸段的平均吸收量較低，Papp均<0.03。其中葛根素和阿魏酸在全腸段的吸收速率和吸收量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，濃度對兩者影響不大；葛根素在十二指腸吸收最快，在回腸吸收最慢也最少，在空腸吸收最多；阿魏酸在十二指腸吸收最快，在結(jié)腸吸收最慢，在空腸吸收量最大，在十二指腸吸收量最小。葛根素的吸收速率和吸收量受時間影響很小，而阿魏酸的吸收速率和吸收量受時間影響變化較大，其中吸收速率隨時間先變快，后變慢，而吸收量也先變大，后變小。

表3 不同濃度藥物中葛根素和阿魏酸全腸段Ka和Papp值

表4 不同腸段葛根素和阿魏酸的Ka和Papp值

圖1 葛根素和阿魏酸Ka隨時間變化曲線

圖2 葛根素和阿魏酸Papp隨時間變化曲線

相關(guān)研究結(jié)果顯示，阿魏酸在全腸段吸收速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且藥材中阿魏酸比單體阿魏酸的腸道吸收速率更快[11]。阿魏酸濃度在20～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，Ka變化不大，在十二指腸、空腸和回腸的吸收較好，在結(jié)腸的吸收較差[12]。復(fù)方配伍時，阿魏酸腸吸收量增加，但藥物濃度增大時，阿魏酸的腸吸收基本無變化。研究顯示，復(fù)方配伍后，隨著藥物濃度增大，葛根素腸吸收增加；其腸吸收量也隨濃度增大而增加，屬于被動吸收[13]。葛根素在腸道內(nèi)的吸收表現(xiàn)為一級動力學(xué)過程，吸收機(jī)制是被動擴(kuò)散，吸收速率較慢[14-15]。研究顯示葛根素與鹽酸小檗堿配伍，在腸道內(nèi)吸收程度和速度隨著鹽酸小檗堿劑量的提高而升高[16]。加入白芷提取物后，葛根素在空腸吸收明顯增加，在空腸灌流實(shí)驗(yàn)中，葛根素Papp與Ka隨藥物濃度增大而逐漸減少，含有P-糖蛋白抑制劑維拉帕米的葛根素Ka與Papp都比單純葛根素吸收增加2倍多[17]。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見本藥對大鼠的腸吸收情況良好，提示可進(jìn)一步對不同比例藥對配伍和與不同藥味組方后的藥動學(xué)研究，以期為其臨床應(yīng)用提供更可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2014-05-10

2014-06-19

夏敬勝(1974-)，男，湖北武漢人，主管藥師，從事醫(yī)院制劑研究。電話：(0)13329703680，E-mail：461981818@qq.com。

蔡瑜(1975-)，男，湖北武漢人，主管藥師，學(xué)士，主要從事醫(yī)院制劑研究。E-mail： 920462684@qq.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)02-0173-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.008