秦一凡，李 茜，2，夏元?dú)J，劉 斌，張 盛

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)可調(diào)諧（氣體）激光技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150080哈爾濱；2.國(guó)家儀器儀表元器件質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，110043沈陽(yáng)）

飛秒激光雙光子熒光顯微系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用

秦一凡1，李 茜1，2，夏元?dú)J1，劉 斌1，張 盛1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)可調(diào)諧（氣體）激光技術(shù)國(guó)家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150080哈爾濱；2.國(guó)家儀器儀表元器件質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，110043沈陽(yáng)）

為進(jìn)行雙光子熒光顯微成像研究，搭建了一套飛秒激光光源雙光子熒光顯微成像系統(tǒng).對(duì)超短脈沖鎖模激光器的成像優(yōu)勢(shì)、雙光子激勵(lì)飽和功率及系統(tǒng)分辨率進(jìn)行了理論推導(dǎo)，利用飛秒激光器、顯微鏡、數(shù)據(jù)采集設(shè)備與控制裝置及掃描控制軟件搭建了顯微成像系統(tǒng)，并對(duì)Rhodamine B樣品進(jìn)行雙光子熒光顯微成像實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明：相同條件下，超短脈沖鎖模激光器的雙光子熒光產(chǎn)率為連續(xù)光輸出激光器的105倍；采用UPLSAPO60XO型物鏡時(shí)，雙光子激勵(lì)飽和功率為50 mW，理論橫向和軸向分辨率為303 nm與727 nm；該系統(tǒng)具有顯微成像能力，且實(shí)際橫向分辨率小于3μm.

飛秒激光；雙光子熒光；羅丹明B；顯微成像

激光共聚焦顯微鏡采用激光作為光源，解決了色差所造成的圖像模糊問(wèn)題.提高圖像質(zhì)量、成像速度及圖像分辨率［1-4］是激光共聚焦技術(shù)的研究重點(diǎn).共焦小孔的使用使得激勵(lì)光與熒光的利用效率極低，限制了圖像質(zhì)量的提高，而成像速度的提高又降低了圖像質(zhì)量［5］.Denk等［6］發(fā)明了第一臺(tái)雙光子熒光顯微鏡，雙光子熒光的非線性本質(zhì)解決了共聚焦對(duì)激勵(lì)光和熒光利用效率低的問(wèn)題，從根本上提高了圖像質(zhì)量，為提高成像速度提供了可能［7-8］.雙光子熒光顯微鏡無(wú)焦外熒光產(chǎn)生，使其具有天然的高分辨率和高信噪比［9］.商業(yè)雙光子熒光顯微鏡價(jià)格昂貴且功能有限，本文自行設(shè)計(jì)了一套費(fèi)用較低且具有良好擴(kuò)展性的雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，并驗(yàn)證了系統(tǒng)的可行性.

1 雙光子熒光顯微成像理論

1.1 超短脈沖鎖模激光器用于雙光子激勵(lì)的優(yōu)勢(shì)分析

雙光子熒光中，單位時(shí)間內(nèi)吸收的光子數(shù)Nabs如下式所示：

式中：C表示染料濃度；V表示被照射體積；σ2表示雙光子吸收截面；函數(shù)S（r）和I0（t）分別描述入射激光的空間和時(shí)間分布．

在不存在受激發(fā)射與熒光淬滅時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)探測(cè)器收集的熒光光子數(shù)可表示為

其中φ、η代表探測(cè)設(shè)備的熒光收集效率以及染料的熒光量子效率．

按時(shí)間平均的光子通量〈F（t）〉的表達(dá)式為

其中g(shù)（2）描述的是激勵(lì)光源的二階時(shí)間相干性．若選擇鎖模激光器作為光源，時(shí)間相干因子g（2）可由輸出脈寬τ及激光器重頻f表示

1.2 雙光子激勵(lì)飽和功率估算

雙光子激勵(lì)的飽和功率為［10］

式中：h表示普朗克常量；c表示真空中光速；λ表示入射光波長(zhǎng)；而NNA是聚焦物鏡的數(shù)值孔徑．

本實(shí)驗(yàn)中，飛秒激光器輸出的鎖模激光中心波長(zhǎng)為800 nm，其重頻為80 MHz；物鏡為Olympus生產(chǎn)的萬(wàn)能平場(chǎng)復(fù)消色差UPLSAPO60XO型物鏡，其具有1.35的數(shù)值孔徑；實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，激光經(jīng)過(guò)各類光學(xué)元件后脈寬被展寬至200 fs；假設(shè)雙光子熒光吸收截面的面積為5×10-50cm4·s；綜上，飽和功率大約為50 mW.

1.3 雙光子顯微成像技術(shù)的分辨率

依據(jù)菲涅耳衍射中的旁軸近似理論，焦點(diǎn)處的束腰可以用來(lái)表示橫向分辨率［11］

其中λ表示入射激光波長(zhǎng)，α表示會(huì)聚角．此時(shí)假設(shè)飛秒激光器輸出脈沖為高斯形狀．

可以將式（6）寫(xiě)成物鏡數(shù)值孔徑NNA的函數(shù)形式

軸向分辨率取決于入射激光在焦點(diǎn)附近軸向上的分布，可以表示為以下形式：

值得注意的是，高數(shù)值孔徑成像系統(tǒng)中入射激光經(jīng)物鏡聚集后便會(huì)迅速聚集起來(lái)，這是由于會(huì)聚角通常較大導(dǎo)致的，而此時(shí)將無(wú)法滿足傍軸近似理論中的小角度近似條件，因此式（7）、（8）僅適用于數(shù)值孔徑較小的情況.

對(duì)應(yīng)于高數(shù)值孔徑系統(tǒng)的衍射理論由Richards和Wolf提出，基于該理論可以得到分辨率的另一種計(jì)算方法［12］：

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的基本情況，可以估算出系統(tǒng)分辨率.實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用UPLSAPO60XO型物鏡，折射率為1.515的松柏油作為填充介質(zhì)，鎖模激光器的中心波長(zhǎng)為800 nm.根據(jù)式（7）～（10）可知，菲涅耳衍射理論的計(jì)算結(jié)果為理想計(jì)算結(jié)果，其橫向分辨率及軸向分辨率分別為259 nm和132 nm，而Richards和Wolf衍射理論的計(jì)算結(jié)果為303 nm和727 nm.通常情況下，使用數(shù)值孔徑更大的物鏡并適當(dāng)縮短入射激光波長(zhǎng)可以提高系統(tǒng)成像分辨率.

2 雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置及控制軟件介紹

實(shí)驗(yàn)中所使用的裝置及軟件如下：

1）飛秒可調(diào)諧激光光源為摻鈦藍(lán)寶石固體激光器Tsunami，其輸出脈寬約50 fs，中心波長(zhǎng)800 nm；

2）二向色鏡為Chroma公司的680dcspxr.從其透過(guò)率和反射率特性可知該二向色鏡對(duì)波長(zhǎng)大于720 nm的光反射率高達(dá)95%，同時(shí)透過(guò)率小于5%，因此可以對(duì)入射激光形成很好的截止作用.其對(duì)450～650 nm范圍的光透過(guò)率高達(dá)95%以上，而熒光波長(zhǎng)在此范圍內(nèi)；

3）發(fā)射濾光片為短波濾光片與帶通濾光片.短波濾光片是Chroma公司的NC212066-ET670sp型產(chǎn)品，其對(duì)400 nm至660 nm范圍內(nèi)的大部分光透過(guò)率高達(dá)99%.帶通濾光片為兆九光公司的BP580-70K型產(chǎn)品，可用于對(duì)Rhodamine B樣品的實(shí)驗(yàn)，該濾光片的透過(guò)中心波長(zhǎng)為580 nm，半寬為70 nm；

4）掃描方式為機(jī)械掃描，平移臺(tái)為Prior公司的H117P2IX，其掃描速度基本滿足實(shí)驗(yàn)需求，根據(jù)掃描平臺(tái)參數(shù)估計(jì)一幅像素為128×128成像時(shí)間約為40 min；

5）物鏡為Olympus公司的PLN 40X與UPLSAPO60XO.當(dāng)物鏡為PLN40X時(shí)，根據(jù)式（7）得到橫向分辨率為596 nm；當(dāng)物鏡為UPLSAPO60XO時(shí)，根據(jù)式（9）～（10）得到橫向分辨率為303 nm；

6）利用C＃語(yǔ)言編寫(xiě)了掃描控制軟件，該軟件在控制平移臺(tái)移動(dòng)時(shí)，同時(shí)記錄了各點(diǎn)坐標(biāo)值及對(duì)應(yīng)坐標(biāo)位置的輸出電信號(hào).目前本實(shí)驗(yàn)室正參照國(guó)際上其他小組編寫(xiě)的ScanImage、MPScope雙光子顯微成像軟件，編寫(xiě)功能更加全面的掃描控制軟件.

2.2 顯微成像系統(tǒng)的搭建過(guò)程及參數(shù)確定

雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)搭建方案的主要光路如圖1所示.

圖1 雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置示意

激光脈沖由摻鈦藍(lán)寶石固體激光器Tsunami發(fā)出，利用擴(kuò)束準(zhǔn)直裝置將飛秒激光變成準(zhǔn)平行光，確保此時(shí)光斑稍大于物鏡入瞳.第一分束片將激光分為兩束，其中一束激光與Ocean Optics HR400光譜儀相連接，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)激光器是否為鎖模狀態(tài).利用中性密度衰減片將另一束激光衰減，隨后激光射入第二分束片，分束后的一部分激光穿過(guò)透鏡到達(dá)PIN型光電二極管，透鏡之前同樣放置了中性密度衰減片衰減激光，以防止由于光電二極管的低閾值引起的飽和現(xiàn)象.另一部分激光入射生物顯微鏡，二向色鏡將激光反射至物鏡，用于激勵(lì)樣品以產(chǎn)生雙光子熒光信號(hào)，通過(guò)二向色鏡的熒光信號(hào)穿過(guò)發(fā)射濾光片并到達(dá)光電倍增管，發(fā)射濾光片為一短波濾光片或帶通濾光片，可以減少由激光與雜散光所形成的噪聲，提高信噪比.利用DCS103數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集光電倍增管及光電二極管的輸出電信號(hào).計(jì)算機(jī)利用掃描控制軟件對(duì)電信號(hào)進(jìn)行處理.計(jì)算機(jī)還利用掃描控制軟件控制控制器，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)平移臺(tái)移動(dòng)的實(shí)時(shí)控制以完成掃描過(guò)程.

激光器的長(zhǎng)時(shí)間工作將會(huì)影響諧振腔的溫度，并可能導(dǎo)致形變的發(fā)生，而且機(jī)械掃描速度較為緩慢，入射激光會(huì)存在能量抖動(dòng).由于雙光子熒光信號(hào)強(qiáng)度正比于激光強(qiáng)度的，激光強(qiáng)度每增大一倍就使得熒光信號(hào)強(qiáng)度增大三倍.如圖1所示，在系統(tǒng)中添加了PIN型光電二極作為能量診斷裝置.由于使用的分束片比例固定，可以通過(guò)PIN型光電二極管的輸出信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)入射激光的能量抖動(dòng)，以保證系統(tǒng)的穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性.

3 雙光子熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)研究

為了驗(yàn)證雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成像能力，對(duì)圖2中的Rhodamine B染料表面進(jìn)行成像.

圖2 Rhodam ine B固體染料照片

利用雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)對(duì)固定在載玻片上的Rhodamine B固體樣品進(jìn)行掃描成像，得到的圖像像素為128×128，如圖3所示.其中圖3（a）未經(jīng)處理.實(shí)驗(yàn)中使用的物鏡為PLN40X，其放大倍數(shù)40×、數(shù)值孔徑0.65.由于雙光子熒光信號(hào)只有在焦點(diǎn)附近才能產(chǎn)生，并且PLN40X物鏡的聚焦后焦點(diǎn)很小，固體染料表面的細(xì)微變化就可以影響熒光信號(hào)的強(qiáng)弱甚至有無(wú)，圖3（a）中的黑點(diǎn)就由此產(chǎn)生.圖3（b）中對(duì)圖像進(jìn)行了平滑及去噪處理，圖3（c）為邊緣檢測(cè)結(jié)果，圖3（d）對(duì)圖像進(jìn)行了平滑及增強(qiáng)處理.圖2、3證明該系統(tǒng)具有對(duì)樣品進(jìn)行雙光子顯微的成像能力.

圖3 Rhodam ine B固體染料雙光子熒光成像及處理結(jié)果

取少量Rhodamine B溶液滴在載玻片上風(fēng)干，風(fēng)干后的Rhodamine B固體粉末狀分布于載玻片上，圖4的放大倍數(shù)為100倍，Rhodamine B風(fēng)干后的固體粉末具有清晰的邊緣.利用雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)對(duì)Rhodamine B粉末進(jìn)行顯微成像研究，并將得到的結(jié)果與賓得K-x數(shù)碼單反相機(jī)拍攝的照片進(jìn)行對(duì)比.

圖4 Rhodam ine B樣品拍攝照片

利用相機(jī)從目鏡口進(jìn)行拍攝，得到Rhodamine B樣品照片，如圖5（a）所示.物鏡放大倍數(shù)為10×，目鏡放大倍數(shù)為10×，顯微鏡內(nèi)置變倍器放大倍數(shù)為1.6×，因此總的放大倍數(shù)應(yīng)為160×.需要說(shuō)明的是拍攝的照片并不能包含整個(gè)視場(chǎng).圖中左上方的曲線為載玻片劃痕，與Rhodamine B粉末成像結(jié)果無(wú)關(guān).對(duì)Rhodamine B粉末完成雙光子熒光顯微成像并對(duì)所得到的圖像進(jìn)行處理，結(jié)果如圖5（b）所示，其尺寸為1 016μm×1 016μm.通過(guò)圖5可以看到，雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)得到的圖像與相機(jī)從目鏡口拍攝得到的結(jié)果想吻合.但由于相機(jī)拍攝的圖片像素為4 288×2 848，相機(jī)拍攝所得結(jié)果更加清晰，而雙光子熒光顯微成像結(jié)果的像素只能達(dá)到128×128.由于機(jī)械掃描速度的限制，實(shí)驗(yàn)中需要耗時(shí)42 min才能得到一幅像素為128×128的圖像，耗時(shí)168 min才能得到一幅像素為256×256的圖像，這無(wú)疑會(huì)影響了雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的圖像分辨率.本實(shí)驗(yàn)室正在搭建的振鏡掃描系統(tǒng)將提高掃描速度，從而提高分辨率.

隨后使用PLN40X物鏡，利用相機(jī)從目鏡口進(jìn)行拍攝，得到的結(jié)果如圖6（a）所示，利用雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行成像并處理所得圖像，結(jié)果如圖6（b）所示，其像素為128×128，尺寸為304.8μm×304.8μm.對(duì)比圖6（a）與圖6（b），發(fā)現(xiàn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)得到的圖像具有較為清晰的細(xì)部特征，而只要增加成像的像素就可以提高圖像清晰度，因此雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)可以在幾百微米大小的動(dòng)植物細(xì)胞研究中得以應(yīng)用.

圖5 Rhodam ine B樣品成像（1 016μm×1 016μm）

圖6 Rhodam ine B樣品成像（304.8μm×304.8μm）

最后，利用UPLSAPO60XO物鏡對(duì)圖4中任意區(qū)域進(jìn)行雙光子熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果如圖7所示，其像素為128×128，尺寸為60.96μm× 60.96μm.黃色箭頭所指的兩個(gè)熒光點(diǎn)間距不超過(guò)3μm，但兩個(gè)點(diǎn)輪廓清晰且沒(méi)有重疊區(qū)域，據(jù)此認(rèn)為該顯微成像系統(tǒng)的橫向分辨率應(yīng)該小于3μm.如果能夠制備出間距更小的熒光點(diǎn)，就可以進(jìn)一步驗(yàn)證橫向分辨率的大小，由于熒光采集設(shè)備、雜散光影響以及圖像處理的問(wèn)題，橫向分辨率雖會(huì)逐漸接近理想分辨率303 nm，但仍會(huì)有差距.

圖7 Rhodam ine B樣品顯微成像（60.96μm×60.96μm）

以上所有的Rhodamine B樣品成像研究中，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中光纖光譜儀輸出顯示激光器鎖模正常，能量診斷裝置監(jiān)測(cè)的激光能量抖動(dòng)均不超過(guò)3%，因此推斷激光能量的抖動(dòng)對(duì)熒光產(chǎn)生影響低于6%.

4 結(jié) 論

1）研究了雙光子熒光顯微成像原理，分析了超短脈沖鎖模激光器用于雙光子熒光顯微成像優(yōu)勢(shì)，估算了雙光子激勵(lì)飽和功率，并對(duì)雙光子熒光顯微成像分辨率進(jìn)行了理論分析.

2）搭建了雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)，并考慮了環(huán)境因素對(duì)飛秒激光器的影響，添加光纖光譜儀及能量診斷裝置以避免失鎖及能量抖動(dòng)的發(fā)生.

3）對(duì)Rhodamine B樣品進(jìn)行雙光子熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該系統(tǒng)具有顯微成像能力.

4）該系統(tǒng)可以清晰地分辨出微米量級(jí)樣品，橫向分辨率小于3μm；由于采用機(jī)械掃描方式，生成一幅像素為128×128的圖像需要約42 min.

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（編輯張 宏）

Construction and application of fem tosecond laser two-photon fluorescencem icroscopy system

QIN Yifan1，LIQian1，2，XIA Yuanqin1，LIU Bin1，ZHANG Sheng1
（1.National Key Laboratory of Science and Technology on Tunable Laser，Harbin Institute of Technology，150080 Harbin，China；2.National Supervising and Testing Center for the Quality of Instruments and Components，110043 Shenyang，China）

By using a femtosecond laser as the excitation source，a two-photon fluorescencemicroscopy system was constructed to conduct some researches on two-photon microcsopy.Firstly，the advantage of introducing an ultrashort pulsemode-locked laser was verified，the definite expression of saturation power was calculated，and the resolution of two-photon fluorescencemicroscopy was deduced.Then based on the femtosecond laser，microscope，data acquisition device，control equipment and the software that we wrote，a two-photon fluorescencemicroscopy system was built.At last，the two-photon fluorescence microscopy system is applied into the microscopy study of Rhodamine B specimen.The results show that in the same condition，two-photon excitation productivity is asmuch as 105times with an ultrashort pulse mode-locked laser compared with a CW laser.By using the UPLSAPO60XO objective，the saturation power is 50 mW while the radial and the axial resolution reach 303 nm and 727 nm.The image ability of the system is proved by the results，and the actual radial resolution is less than 3μm.

femtosecond laser；two-photon fluorescence；Rhodamine B；microscopy

TN431.2

：A

：0367-6234（2015）11-0001-05

10.11918／j.issn.0367-6234.2015.11.001

2014-09-15.

國(guó)家自然科學(xué)基金（61275157）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（HIT.KLOF.2010033）；哈爾濱工業(yè)大學(xué)理工醫(yī)交叉學(xué)科基礎(chǔ)研究培育計(jì)劃（HIT.IBRSEM 201314）；哈爾濱工業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（HIT.NSRIF.2009011）.

秦一凡（1990—），男，博士研究生；夏元?dú)J（1968—），男，教授，博士生導(dǎo)師.

夏元?dú)J，xiayuanqin＠hit.edu.cn.