蔣曉麗 郭燕君 楊莉佳 王丹萍 黃文潔 董佳佳 徐營

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

卵母細(xì)胞孤雌激活及紡錘體形態(tài)改變*

蔣曉麗 郭燕君 楊莉佳 王丹萍 黃文潔 董佳佳 徐營△

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

目的：探討不同激活方法小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活的效率及紡錘體的變化。方法：小鼠卵母細(xì)胞采用乙醇、氯化鍶化學(xué)激活，研究孤雌激活效果；采用免疫熒光染色法觀察孤雌激活下卵母細(xì)胞紡錘體的動態(tài)變化。結(jié)果:(1)8%乙醇處理10、15 min的桑囊率高于處理5 min；(2)10 mmol·L-1氯化鍶激活率高于2.5、5 mmol·L-1；(3)激活過程中紡錘體形態(tài)發(fā)生了改變。結(jié)論：8%乙醇處理時(shí)間相對延長有利于提高桑囊率；高濃度氯化鍶激活效果較好；孤雌激活后紡錘體形態(tài)會發(fā)生改變。

卵母細(xì)胞；孤雌激活；紡錘體

小鼠卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育與人類存在較多相似之處，是理想的實(shí)驗(yàn)對象，孤雌激活胚胎與精卵結(jié)合胚胎有相同的全能性和分裂能力，能夠定向分化和發(fā)育[1]。雖然已有研究表明孤雌激活的小鼠胚胎存活且能發(fā)育成具有繁殖能力的成熟個體[2]，也有學(xué)者通過孤雌激活技術(shù)建立小鼠胚胎干細(xì)胞體系[3]，但是孤雌激活的小鼠胚胎很少能發(fā)育至足月出生，這可能與體外胚胎培養(yǎng)的環(huán)境設(shè)定密切相關(guān)。目前孤雌激活方法有電激活，化學(xué)激活，聯(lián)合激活等。電激活因難以控制電場力、脈沖頻率等受限，其產(chǎn)生的不適宜刺激也會影響胚胎分化發(fā)育。多種化學(xué)試劑聯(lián)合激活的方式因其較高的激活效率而廣為使用，但尋求高效的激活方法提高激活效率仍是目前研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)亦采用免疫熒光染色法，觀察卵母細(xì)胞激活后染色體的動態(tài)改變。

1 材料與方法

1.1 材料

6-8周齡性成熟雌性ICR小鼠，約30 g·只-1，100只。自然條件下飼養(yǎng)，自由采食飲水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠超數(shù)排卵和卵母細(xì)胞搜集

實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素10 IU·只-1，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素10 IU·只-1。于注射人絨毛膜促性腺激素后14-17 h頸椎脫臼處死小鼠，用眼科剪、眼科鑷配合，無菌條件下分離輸卵管，將輸卵管置于無Ca2+CZB培養(yǎng)液中，在體視顯微鏡下刺破輸卵管膨大部，釋放卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，用透明質(zhì)酸酶(300 IU·ml-1)處理5-6 min，脫去卵丘細(xì)胞，獲得卵母細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和處理

1.2.2.1 8%乙醇處理不同時(shí)間

8%乙醇(無水乙醇配置)分別處理卵母細(xì)胞5 min，10 min，15 min，清洗5次后移入含有4 mg·L-1BSA的G1培養(yǎng)液中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察。

1.2.2.2 不同濃度氯化鍶處理相同時(shí)間

分別使用2.5 mmol·L-1，5 mmol·L-1，10 mmol·L-1氯化鍶的無Ca2+CZB中處理卵母細(xì)胞4 h，清洗5次后移入含有4 mg·L-1BSA的G1培養(yǎng)液中，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察。

1.2.2.3 β-微管蛋白的免疫熒光染色

①固定：將孤雌激活后進(jìn)入減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞移入無鈣、鎂DPBS(Hyclone公司產(chǎn)品)配制的3.7%多聚甲醛中，室溫(25℃)固定40 min或在40℃過夜。

②清洗：將固定后的樣品移入清洗液中[含0.3%BSA(Roche公司產(chǎn)品)的DPBS]中清洗3次，每次5 min。

③透膜：將清洗后的樣品移入透膜液[清洗液中加入0.2%TritonX-100(Amresco公司產(chǎn)品)]中，在37℃溫箱中溫育40 min，增加細(xì)胞膜的通透性，以利于抗體進(jìn)入。

④清洗：將透膜處理后的樣品移入含0.01% TritonX-100清洗液中清洗3次，每次5 min。

⑤封閉：每毫升清洗液中添加0.01125 g甘氨酸(Amresco公司產(chǎn)品)和10 mgBSA作為封閉液，37℃溫育1 h。

⑥一抗結(jié)合：樣品放入1:160封閉液稀釋的小鼠抗β-微管蛋白的抗體(Monoclonal anti-β-tubulin，Sigam公司產(chǎn)品)中，37℃溫育1 h。

⑦清洗：清洗液中清洗3次，每次5 min。

⑧二抗熒光標(biāo)記：樣品與1:100清洗液稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(FITC-goat-antimouse IgG，Sigam公司產(chǎn)品)37℃溫育40 min。

⑨清洗：清洗液中清洗3次，每次5 min。

1.2.2.4 PI染色

將經(jīng)過微管染色樣品清洗后，在含有15 μg·ml-1碘化丙啶(PI，Sigam公司產(chǎn)品)的清洗液中室溫下溫育10 min。

1.2.2.5 封片

在潔凈的載玻片上，用凡士林：石蠟(9:1)混合物，根據(jù)蓋玻片大小，在4個小柱的中央滴一滴防熒光淬滅劑(DABCO，Sigam公司產(chǎn)品)，將上述經(jīng)PI染色后的樣品在清洗液滴中稍清洗，立即移入防熒光淬滅劑中，將蓋玻片輕放在4個小柱上，小心按壓蓋玻片，使樣品位置固定，并稍擴(kuò)展而不被壓碎，用無色指甲油封片。

1.2.2.6 激光共聚焦顯微術(shù)觀察

在激光共聚焦顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞中β-微管蛋白的形態(tài)和分布情況，拍照記錄。

2)保證支架合理工作狀態(tài)。采取及時(shí)移架和限量放煤等方法，減少頂煤冒落，將支架頂梁仰俯角變化范圍控制在±10°，防止后柱受力過小甚至出現(xiàn)拉力。

1.3 激活鑒定

判斷卵母細(xì)胞激活的標(biāo)準(zhǔn)是形成一個原核、兩個原核或出現(xiàn)兩個極體。胞質(zhì)破裂、核結(jié)構(gòu)消失或結(jié)構(gòu)損傷的卵母細(xì)胞歸于退化。

1.4 觀察、數(shù)據(jù)搜集

采用倒置熒光顯微鏡于激活后24 h觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后每日定時(shí)觀察，直至胚胎體外培養(yǎng)至囊胚期，一般為4天左右。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，均由SPSS17.0軟件包處理。

2 結(jié)果

8%乙醇處理5，10，15 min的激活率相當(dāng)，但10，15 min的桑囊率高于處理5 min者(x2=1.865，p=0.394)，見表1。

孤雌激活后紡錘體呈現(xiàn)與質(zhì)膜平行、向細(xì)胞內(nèi)部移動、消失三種形態(tài)變化。以下三圖顯示乙醇處理后紡錘體形態(tài)變化，見圖1。

3 討論

孤雌激活的目的是模擬精卵結(jié)合受精的過程，誘導(dǎo)內(nèi)源性Ca2+升高，但其峰值常較精卵受精低，形成的單一Ca2+流只能降低細(xì)胞成熟促進(jìn)因子(MPF)的活性而不能維持低水平的蛋白激酶(MAPK)，MPF、MAPK對于減數(shù)分裂至關(guān)重要[4]。也有報(bào)道顯示老化的小鼠卵母細(xì)胞可自發(fā)孤雌激活，且不同老化時(shí)期的卵子隨著老化時(shí)間延長，孤雌激活率明顯增加[5]。自發(fā)孤雌激活亦是MAPK活性降低、MPF失活導(dǎo)致細(xì)胞衰老的主要表現(xiàn)之一[6]。

表1 8%乙醇處理不同時(shí)間對激活效率的影響

表2 不同濃度氯化鍶處理對激活效率的影響

(a)紡錘體與質(zhì)膜平行

(b)紡錘體向細(xì)胞內(nèi)移動 (c)紡錘體消失

本實(shí)驗(yàn)研究了乙醇、氯化鍶激活。乙醇(EH)是孤雌激活的試劑之一，其能水解卵母細(xì)胞膜上4,5-二磷酸肌醇(PIP2)生成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，改變卵母細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)內(nèi)源性Ca2+升高，增加肌漿網(wǎng)Ca2+釋放以及外源性Ca2+內(nèi)流[7]。從而形成類似受精作用下內(nèi)源性Ca2+升高的現(xiàn)象，促進(jìn)孤雌激活的進(jìn)行。但是其激活效果并不高。本實(shí)驗(yàn)以8%的乙醇激活，時(shí)間設(shè)為5，10，15 min，三種情況下小鼠卵母細(xì)胞的孤雌激活率相當(dāng)，但桑囊率并不高，與李光鵬、李子義等的報(bào)道相似[8]。

氯化鍶被認(rèn)為是較為有效的孤雌激活試劑[9,10]。其激活原理在于鍶離子與鈣離子為同族二價(jià)離子，鍶離子能置換出肌質(zhì)網(wǎng)中儲存的Ca2+，引起卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)多重Ca2+流，提高激活效率。本實(shí)驗(yàn)采用2.5 mmol·L-1，5 mmol·L-1，10 mmol·L-1氯化鍶處理卵母細(xì)胞4 h，結(jié)果顯示10 mmol·L-1的氯化鍶濃度激活率前二者，但三種激活濃度下桑囊率均較低，這可能與氯化鍶只能作用于孤雌激活的前期有關(guān)。

卵母細(xì)胞的成熟過程中，細(xì)胞器會發(fā)生一系列變化以保證減數(shù)分裂的正常進(jìn)行，其中細(xì)胞骨架起著重要作用。細(xì)胞骨架是遍布于卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)，紡錘體是卵母細(xì)胞成熟中的一種主要細(xì)胞骨架成分，它是細(xì)胞的一種支撐結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞器的定位、生殖細(xì)胞的成熟、卵母細(xì)胞的受精起著重要的作用[13]，其完整性決定了染色體分裂的正確性，其正常生成則是染色體排列的必要條件。紡錘體生成后一般會有5-20 min的延遲，以供卵母細(xì)胞調(diào)整著絲點(diǎn)上微管束的極性，以及決定是否所有的著絲點(diǎn)都附著正確，紡錘體組裝檢查點(diǎn)(SAC)函數(shù)作為監(jiān)測機(jī)制，能發(fā)現(xiàn)染色體錯位和推遲后期，直到糾正錯誤。本實(shí)驗(yàn)通過對乙醇處理后紡錘體的免疫熒光染色檢查，顯示紡錘體與質(zhì)膜平行，向細(xì)胞內(nèi)部移動和消失三種不同的變化，當(dāng)紡錘體與質(zhì)膜平行時(shí)，減數(shù)分裂可繼續(xù)進(jìn)行[14]，而后兩種變化勢必會影響減數(shù)分裂過程中染色體的排列和向細(xì)胞兩級移動，導(dǎo)致減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行，以致不能發(fā)育至囊胚期。

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Parthenogenetic action of oocytes and the change of spindle*

Jiang Xiao-li, Guo Yan-jun, Yang Li-jia, Wang Dan-ping, Huang Wen-jie, Dong Jia-jia, Xu Ying△

(Medical College of Jiaxing University, Zhejiang Jiaxing 314001)

Objective：To evaluate the efficiency of mice oocytes parthenogenetic activation by different activation methods and the change of the spindle. Method: Oocytes were obtained from mice ovaries. Parthenogenetic activation effect of mouse oocytes were researched after activation by ethanol, strontium chloride chemical activation. Oocytes dynamic changes of the spindle were observed by immunofluorescence staining after parthenogenetic activation. Results: (1) Mulberry sac rate of 8% ethanol processing 10, 15 min is higher than the treatment 5 min; (2) the strontium chloride activation rate for 10 mmol·L-1is higher than 2.5, 5 mmol·L-1; (3) Spindle shape has changed during the process of activation. Conclusion: Relative to extend the processing time of 8% ethanol is beneficial to increase mulberry sac rate; High concentrations of strontium chloride activation effect is better; spindle morphology changes after parthenogenetic activation.

Oocyte; Parthenogenetic activation; Spindle

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號：2014R417002)和嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2013AY21046)資助

蔣曉麗，女，本科在讀，Email：570813426@qq.com。

Δ通訊作者：徐營，男，教授，主要從事胚胎學(xué)研究，Email：563031020@qq.com。

2015-3-23)