石小丹等

摘 要：系統(tǒng)研究了典型碳源、 氮源、金屬離子、磷酸鹽以及初始pH值等因素對(duì)重組大腸桿菌產(chǎn)酮基還原酶的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，甘油、酵母浸粉FM888、酵母蛋白胨FP101、MgSO4· 7H2O以及離子濃度為0.1 mol·L-1 pH 值為T7 的磷酸緩沖液對(duì)菌體生長(zhǎng)以及酶活的表達(dá)有一定的促進(jìn)作用。通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)及分析得到培養(yǎng)基的最優(yōu)配方：甘油 6.86 g·L-1， FM888 19.53 g·L-1， FP101 8.37 g·L-1， MgSO4· 7H2O 2.50 g·L-1， K2HPO4 14.96 g·L-1， KH2PO4 7.34 g·L-1。優(yōu)化條件下酶活為431.21 U·mL-1，比優(yōu)化前（70.25 U·mL-1）提高了5.13倍。此研究可為工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：酮基還原酶；重組大腸桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；均勻設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.001

Abstract： The effects of a number of factors on the production of keto reductase were systematically studied， typically including carbon source， nitrogen source， phosphate and initial pH. The research results of single factor experiment showed that the growth and enzyme activity were promoted by glycerin， yeast extract FM888， yeast peptone FP101， MgSO4 ·7H2O， and phosphate buffer with pH 7 and 0.1 mol·L-1 ion concentration. Through uniform design experiments， the optimal conditions were obtained as follows： Glycerol 6.86 g·L-1， FM888 19.53 g·L-1， FP101 8.37 g·L-1， MgSO4 7H2O 2.50 g·L-1， K2HPO4 14.96 g·L-1， KH2PO4 7.34 g·L-1. Under the optimal conditions， the activity of keto reductase reached 431.21 U·mL-1， which was 5.13 times greater than that of the basic fermentation conditions previously（70.25 U·mL-1）. This research could provide theoretical guidance for large-scale production of keto reductase.

Key words： keto reductase； recombinant Escherichia coli； medium formulation optimization； uniform design

酮基還原酶（Keto reductase， KR）是一類依賴還原型輔酶Ⅱ（Nicotinamide adenine dinucleotide hydro-phosphate acid， NADPH）將酮類化合物不對(duì)稱性還原成手性化合物的氧化還原酶，在手性化合物合成與拆分領(lǐng)域中具有廣泛用途。在酮基還原酶的作用下，價(jià)格低廉的酮類化合物可被催化還原成手性前體物，這將成為制藥工業(yè)的一種新的工藝技術(shù)思路[1]。例如4-氯乙酰乙酸乙酯（4-chloroacetoacetate， COBE）經(jīng)酮基還原酶轉(zhuǎn)化為手性化合物4-氯-3-羥基-丁酸乙酯（4-chloro-3-hydroxybutyrate， CHBE），后者是合成L-肉堿的前提物[2]。但由于天然酶的表達(dá)量較低，因此利用基因克隆技術(shù)，將含有KR基因的質(zhì)粒重組到大腸或者酵母細(xì)胞[3]中表達(dá)目標(biāo)酶成為了研究熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)KR的研究仍僅限于基因的改造和優(yōu)化方面的研究[4-6]，對(duì)于重組菌發(fā)酵生產(chǎn)KR的影響因素及過(guò)程調(diào)控方面的研究甚少，尤其是針對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)KR的培養(yǎng)基優(yōu)化方面的報(bào)道從未見到。

均勻設(shè)計(jì)（Uniform design，UD）是中國(guó)數(shù)學(xué)工作者方開泰等[7]于 20 世紀(jì) 70年代末提出的一種新的多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，其出發(fā)點(diǎn)是將試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)安排均勻分散，使試驗(yàn)點(diǎn)在數(shù)值積分范圍內(nèi)散布均勻，使布點(diǎn)離被積函數(shù)的各種值充分接近，所用試驗(yàn)點(diǎn)不多卻能使積分值得到很好的近似[8]。它與正交設(shè)計(jì)、響應(yīng)面方法等其他試驗(yàn)設(shè)計(jì)法的最大不同之處就在于，能從盡可能少的試驗(yàn)次數(shù)中揭示出因素對(duì)指標(biāo)的影響大小和規(guī)律；能以最少的次數(shù)， 從多個(gè)因素中找出影響試驗(yàn)結(jié)果的各因素的主次和最優(yōu)結(jié)果。本文首先利用單因素試驗(yàn)法找出適合重組大腸桿菌生產(chǎn)KR的發(fā)酵培養(yǎng)基成分，然后用均勻設(shè)計(jì)方法對(duì)培養(yǎng)基各組分添加量進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)， 以提高KR的酶活并降低生產(chǎn)成本， 為大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌含有KR外源基因的質(zhì)粒，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。質(zhì)粒以氨芐抗性基因作為標(biāo)記基因，以阿拉伯糖為啟動(dòng)子。

1.1.2 試劑 L-阿拉伯糖、NADPH、COBE和CHBE等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；酵母蛋白胨（FP101）和酵母浸粉（FM888）為安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨，NaCl，酵母抽提物5，瓊脂粉15。TB培養(yǎng)基（種子以及發(fā)酵初始培養(yǎng)基，g·L-1）：甘油4，酵母抽提物24，酵母蛋白胨12，KH2PO4 2.31， K2HPO4 12.54，pH 值7.0。

1.1.4 誘導(dǎo)劑溶液 L-阿拉伯糖溶液濃度為0.05 g·mL-1。

1.1.5 氨芐青霉素貯存液 氨芐青霉素購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司， 用無(wú)菌超純水配成 100 mg·mL-1， 分裝在EP管中， -20 ℃凍存， 使用時(shí)每 1 mL 培養(yǎng)基加入 l μL， 終質(zhì)量濃度為 100 μg·mL-1。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)：SP-754型，上海天普分析儀器有限公司；超聲波破碎儀： 04711-45型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)方法：方法參見參考文獻(xiàn)[9]。

發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶：將種子液按1%接種量接入裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶后，在30 ℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)2 h后加入 0.5 mL 滅過(guò)菌的L-阿拉伯糖溶液， 繼續(xù)培養(yǎng)22 h，獲取菌體。

1.3.2 粗酶液獲取方法 將發(fā)酵液離心取菌體2 g，向菌體中加入pH值為9.0的 Tri-HCl緩沖溶液20 mL，攪拌均勻后，在4 ℃下超聲波破碎，離心后取上清液即為粗酶液。

1.3.3 檢測(cè)方法 菌體量測(cè)定 ：發(fā)酵結(jié)束后，將稀釋適當(dāng)倍數(shù)的發(fā)酵液放置分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)為600 nm下測(cè)量吸光值。

KR酶活檢測(cè)：以COBE為底物， NADPH為輔酶，利用紫外可見光分光光度計(jì)在340 nm下，通過(guò)連續(xù)測(cè)定NADPH消耗量來(lái)計(jì)算酶活力，具體方法見參考文獻(xiàn)[10]。定義酶活：在40 ℃，pH值為6.0條件下，每分鐘消耗1 μmol NADPH所需要的酶量為1個(gè)國(guó)際單位（U）。

1.3.4 均勻設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析 本試驗(yàn)采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 DPS 軟件進(jìn)行逐步回歸分析[11]，篩選顯著變量，建立回歸方程，并通過(guò)回歸方程求取極值，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)KR的影響

碳源為微生物生長(zhǎng)提供能量，不同微生物利用碳源物質(zhì)的范圍各不相同，因此為重組菌選擇適合的碳源至關(guān)重要。本試驗(yàn)以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將其碳源改為葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、淀粉，每種碳源以不同的質(zhì)量濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%）進(jìn)行添加，其他成分不變， 按照1.3.1方法培養(yǎng)，在誘導(dǎo)發(fā)酵22 h后測(cè)定酶活和生物量，生物量以菌液OD600表示，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，不同的碳源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響很大。相較于其他三者，重組大腸桿菌對(duì)葡萄糖和甘油的利用率較好，當(dāng)二者添加濃度分別為1%和1.5%時(shí)OD600達(dá)到最大值，分別為 22和 21。就產(chǎn)KR酶的情況而言，添加1%甘油時(shí)，酶活最大為70.25 U·mL-1。葡萄糖雖然能更好地促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但酶活產(chǎn)量不高。可能因?yàn)槠咸烟沁M(jìn)入細(xì)胞中后通過(guò)糖酵解途徑，會(huì)產(chǎn)生丙酮酸，再經(jīng)其他代謝途徑，會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等代謝副產(chǎn)物，而這些副產(chǎn)物會(huì)抑制KR的合成。選擇合適的碳源添加量非常重要，添加過(guò)高或過(guò)低對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都有一定的抑制作用。因此，基于生長(zhǎng)與產(chǎn)酶兩方面考慮，選擇甘油為最佳碳源，且最佳添加濃度為1%。

2.2 不同氮源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)KR的影響

氮是微生物細(xì)胞中需要量?jī)H次于碳的元素，分為有機(jī)態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài)氮，不同菌種對(duì)不同來(lái)源的氮素利用程度不同[11]。前期試驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)以無(wú)機(jī)氮為唯一氮源時(shí)，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶受到了極大的抑制（發(fā)酵結(jié)束后，OD600低于2，酶活幾乎沒有），因此本試驗(yàn)以考察不同有機(jī)氮源對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以甘油為碳源，添加濃度為1%，其他成分不變，將 TB 中的氮源（蛋白胨和酵母膏）替換為胰蛋白胨（Tryptone），牛骨蛋白胨（Beef peptone），酵母蛋白胨FP101，酵母浸出物FM888以及FM818，每種氮源以不同的質(zhì)量濃度（2%，4%，6%，8%）進(jìn)行添加，按照1.3.1方法培養(yǎng)，在誘導(dǎo)發(fā)酵22 h后測(cè)定酶活和生物量，結(jié)果如圖2。

潘冬瑞等[12]通過(guò)對(duì)FM888和FP101對(duì)大腸桿菌發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)FM888中游離氨基酸含量高，可以迅速被大腸桿菌利用，能夠使菌體快速積累到最大值，而由于肽類含量較低，對(duì)于穩(wěn)定期產(chǎn)酶的持續(xù)增效作用不夠，研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)FM888與FP101以7∶3比例混合使用時(shí)，可將游離氨基酸和肽類含量調(diào)整到合適水平，既能滿足菌體快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，又可促進(jìn)鹵醇脫鹵酶的持續(xù)高效表達(dá)，增強(qiáng)發(fā)酵后勁。相較于FM888，F(xiàn)P101游離氨基酸含量稍低，肽類含量卻相對(duì)較高。從圖2也可以看出，相較于其他氮源FM888更有利于菌體生長(zhǎng)，且當(dāng)添加量為6%時(shí)高達(dá)26。而當(dāng)以4%的FP101為氮源時(shí)，KR的酶活最高，為79.53 U·mL-1，說(shuō)明KR的表達(dá)所需的氮源與潘冬瑞等[12]研究重組大腸桿菌產(chǎn)鹵醇脫鹵酶相似。因此結(jié)合文獻(xiàn)以及試驗(yàn)結(jié)果選擇FM888和FP101為復(fù)合碳源，混合比為7∶3，總添加量為4%。

2.3 不同金屬離子對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)KR的影響

金屬離子不僅可以調(diào)節(jié)和維持微生物生長(zhǎng)過(guò)程中諸如滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位等生長(zhǎng)條件，如 Na+和 Ka+有調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的作用[13]；還可以參與并穩(wěn)定微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，如Mg2+有穩(wěn)定核糖體和細(xì)胞膜的作用；某些金屬離子甚至與酶的組成有關(guān)，如Mg2+、Zn2+和Cu2+是許多酶的激活劑[9]。本試驗(yàn)考察Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+ 等5種金屬離子對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加Nacl， MgSO4· 7H2O， CaCl2， ZnSO4· 7H2O， CuSO4· 5H2O，每種物質(zhì)以不同的濃度（0， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 g·L-1）進(jìn)行添加，在甘油為1%，F(xiàn)M888與FP101分別為2.8%，1.2%，TB中其他成分不變條件下發(fā)酵，收獲菌體后所測(cè)得的結(jié)果如圖3所示。

圖3顯示，相較于空白組，5種金屬離子的添加對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，但對(duì)KR的表達(dá)的影響較大，除Ca2+外，其他4種金屬離子在添加量合適的情況下均對(duì)酶活有一定的促進(jìn)作用。尤其是Mg2+，當(dāng)添加量為0.5 g·mL-1時(shí)，酶活達(dá)到80.73 U·mL-1。因此，發(fā)酵生產(chǎn)KR時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加0.5 g·L-1的MgSO4· 7H2O。

2.4 磷酸根離子對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)KR的影響

在微生物菌體的能量代謝中，磷元素起重要作用。一方面，磷元素是構(gòu)成三磷酸腺苷、核酸和脂類的重要組分，它的存在有利于能量的代謝；另一方面，培養(yǎng)基中的磷元素常以 PO43-的形式存在，能起緩沖 pH 值的作用。本試驗(yàn)參考TB培養(yǎng)基，以K2HPO4和KH2PO4為培養(yǎng)基中PO43-來(lái)源，配置pH值 為7，離子濃度分別為0.01，0.05， 0.1，0.15，0.2 mol·L-1以及離子濃度為0.1 mol·L-1，pH值 分別為 6.0，6.5， 7.0， 7.5 ，8.0 的緩沖溶液，用磷酸緩沖溶液作為培養(yǎng)基中其他成分（甘油10，F(xiàn)M888 28，F(xiàn)P101 12，MgSO4· 7H2O 0.5）的溶劑配置相應(yīng)的培養(yǎng)基，考察磷酸根離子的濃度以及培養(yǎng)環(huán)境的初始pH值對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)KR的影響，其試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，pH值為7時(shí)，磷酸鹽離子濃度對(duì)重組大腸桿菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶的影響較小，根據(jù)測(cè)量結(jié)果可知，離子濃度在0.05～0.2 mol·L-1時(shí)KR酶活較高。反之，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)菌體繁殖以及產(chǎn)酶影響較大，結(jié)果顯示pH 值7 為最佳初始pH值。

2.5 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化

單因素試驗(yàn)已初步選出培養(yǎng)基的主要成分以及最優(yōu)添加量。試驗(yàn)結(jié)果顯示：選取甘油 10 g·L-1，酵母浸出物（FM888）以及酵母蛋白胨（FP101）7∶3混合物 40 g·L-1，七水硫酸鎂 0.5 g·L-1用pH值為7，離子濃度為0.05 mol·L-1的磷酸鹽配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基有利于菌體的生長(zhǎng)以及酶活的提高?；趩我蛩卦囼?yàn)，以KR酶活為響應(yīng)值，利用均勻設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基各成分的最優(yōu)添加量。試驗(yàn)因素以及試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)如表1。

用 DPS 軟件均勻設(shè)計(jì)模塊對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次逐步回歸分析，得出酶活與各因素關(guān)系的方程為：

Y=-1 891.20+302.22X1 +15.62X2 +4 139.311X3-12.44X1×X1-8 728.25X3×X3-35.17X1×X4-181.66X2×X3+0.99X2×X4+3 575.811X3×X4

此方程回歸結(jié)果如表 3 所示。

模型的復(fù)相關(guān)系數(shù) r= 0.999 7，修正的決定系數(shù)0.999 3，F(xiàn)= 350.17，P= 0.002 9，剩余標(biāo)準(zhǔn)差 S= 1.596，模型的各個(gè)變量在α=0.05的水平上均顯著，說(shuō)明模型選擇比較恰當(dāng)。優(yōu)化后重組大腸桿菌產(chǎn)酮基還原酶培養(yǎng)基配方為：甘油 6.86 g·L-1、FM888 19.53 g·L-1、FP101 8.37 g·L-1、 MgSO4· 7H2O 2.50 g·L-1、 K2HPO4 14.96 g·L-1和 KH2PO4 7.34 g·L-1。酶活擬合結(jié)果為448.01 U·mL-1，實(shí)測(cè)結(jié)果為431.21 U·mL-1，與優(yōu)化前酶活（70.25 U·mL-1）比較提高了5.13倍，說(shuō)明該培養(yǎng)基配方較佳。

3 結(jié) 論

培養(yǎng)基是微生物的生活環(huán)境，其組成對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成有很大的影響，因此在建立一個(gè)發(fā)酵過(guò)程的時(shí)候，往往需要對(duì)所用的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)首先利用單因素試驗(yàn)篩選了培養(yǎng)基組分并初步優(yōu)化了各組分的添加濃度；其次，為了進(jìn)一步考察各因素對(duì)酶活的相互影響，本試驗(yàn)選定 U12（122×62）混合水平的均勻設(shè)計(jì)表對(duì)各因素的添加濃度在更小范圍進(jìn)行優(yōu)化；試驗(yàn)最終優(yōu)化得到的酶活高達(dá)431.21 U·mL-1，是優(yōu)化前（TB培養(yǎng)基）酶活（70.25 U·mL-1）的5.13倍，較大幅度提高了KR生產(chǎn)效率，為KR酶的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，并對(duì)KR酶的工業(yè)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)作用。

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