劉 祥

（陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中 723001）

福氏志賀菌（Shigellaflexneri）為革蘭陰性致病菌，屬于高度傳染性和危害嚴重的急性腸道傳染病，臨床上可引起細菌性痢疾，病死率高［1-2］；世界各地都有流行，尤其是發(fā)展中國家，患病群體主要為兒童［3］。隨著抗生素的濫用，福氏志賀菌產(chǎn)生不同程度的耐藥性［4］，有待開發(fā)一種新型的安全、無耐藥性的亞單位疫苗。外膜蛋白 A（outer membrane protein A，OmpA）為革蘭陰性菌主要外膜蛋白之一［5］，可促進福氏志賀菌與宿主菌的黏附與侵襲［6］，是福氏志賀菌主要毒力蛋白。此外，研究發(fā)現(xiàn)將OmpA免疫小鼠可激活機體的細胞免疫和體液免疫水平［7］，并產(chǎn)生很小的炎癥反應(yīng)，對福氏志賀菌的感染有很強的免疫保護作用［7-8］。有望作為一種新型的亞單位蛋白疫苗［9］。

本研究利用分子克隆方法獲得福氏志賀菌OmpA蛋白表達菌株；純化OmpA蛋白，免疫小鼠，制備小鼠OmpA抗血清；為OmpA蛋白介導福氏志賀菌侵染宿主的靶向蛋白研究，以及OmpA免疫保護功能及疫苗的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與實驗動物Shigellaflexneri2a，E.coliDH5α，E.coliBL21菌株，pET-32a質(zhì)粒本實驗室保存；昆明鼠購于西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶，Taq酶，T4-DNA連接酶，核酸標準，蛋白標準均購自寶生物工程（大連）技術(shù)服務(wù)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自上海生物工程公司；引物由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司合成；基因測序為北京奧科鼎盛生物科技有限公司；IPTG、二抗為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 OmpA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 依據(jù)NCBI公布的福氏志賀菌2a菌株OmpA基因序列。設(shè)計引物：正向引物：5′-ACAGGATCCATGAAAAAGACAGCTAT-3′；逆向引物：5′-GCTAAGCTTTTAAGCCTGCGGCTGAGT-3′，下劃線為BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點。PCR采用50μL反應(yīng)體系：緩沖液5μL，基因組模板3μL，10mmol／L dNTP 2μL，25μmol／L引物各1μL，Taq酶0.5 μL，補水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，55℃ 45s，72℃ 90s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，16℃終止反應(yīng)。采用8g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片段大小。將PCR產(chǎn)物與pET-32a質(zhì)粒載體雙酶切后，利用T4-連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，提取重組質(zhì)粒雙酶切檢測與測序檢測確認后，轉(zhuǎn)入表達菌株E.coliBL21，構(gòu)建重組蛋白的表達菌株。

1.2.2 OmpA重組蛋白的表達檢測與純化 將重組表達菌株于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.5時，加入終濃度0.5mmol／L IPTG，37℃誘導培養(yǎng)6h，收集菌體，SDS-PAGE蛋白電泳檢測OmpA表達情況；并利用SDS-PAGE電泳切膠的方法，對OmpA蛋白進行純化。

1.2.3 OmpA重組蛋白的復(fù)性 采用尿素濃度梯度的方法復(fù)性蛋白，主要步驟為：將純化的OmpA蛋白溶解于8mol／L尿素溶液并置透析袋中，然后放入含6mol／L 尿素的50mmol／L Tris-HCl（pH 7.4）中，4℃放置4h；接著依次為4、2、1、0.5mol／L尿素，最后置于50mmol／L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置4h；接著離心取上清溶液，吸取2μL用于蛋白電泳檢測。

1.2.4 OmpA重組蛋白小鼠多克隆抗體制備 選取約5周齡的昆明鼠6只，50μg／只免疫OmpA蛋白，首次免疫采用弗氏完全佐劑。第1次免疫14d后進行第2次免疫，7d后，進行第3次加強免疫，再7d后小鼠眼部取血并置于4℃冰箱中析出，最后離心取上清，置-80℃冰箱中保存待用。

1.2.5 OmpA重組蛋白抗體效價檢測 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測抗血清效價，主要步驟為：將OmpA蛋白溶解至0.05μg／μL，在相應(yīng)的96孔板中加入100μL溶液，37℃ 作用1h，然后加入300μL封閉液，37℃ 孵育2h，接著每孔加100μL不同滴度的小鼠一抗血清，37℃孵育30min；充分洗滌后加入100μL二抗，37℃作用30min；充分洗滌加入底物A與底物B的混合液100μL，37℃避光顯色10min，迅速加入終止液，最后置于酶標儀450 nm處讀OD值。

1.2.6 OmpA重組蛋白抗體特異性檢測 利用Western blot方法檢測小鼠 OmpA抗血清特異性［10］。為避免OmpA重組蛋白中的融合蛋白所產(chǎn)生抗體對試驗結(jié)果的影響，將福氏志賀菌培養(yǎng)，收集菌體裂解后進行SDS-PAGE蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)NC膜，與不同稀釋度的小鼠抗血清（對照為陰性抗血清）作用1h，然后加入二抗孵育1h，最后DAB顯色，確定OmpA抗血清的特異性。

1.2.7 OmpA蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的OmpA蛋白氨基酸序列，利用DNAMan軟件進行同源性分析；采用MEGA軟件Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建

通過PCR擴增獲得約1 000bp左右片段，與目的基因大小一致（圖1-A1）。將PCR獲得的目的基因片段與pET-32a質(zhì)粒進行雙酶切處理后，T4-DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化克隆菌株E.coliDH5α。提取重組質(zhì)粒，BamHⅠ與HindⅢ雙酶切處理，獲得大小與預(yù)測一致的1 047bp片段（圖1A2）。此外，序列測序結(jié)果證實目的基因與公布的序列相同。

圖1 福氏志賀菌OmpA基因重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Recombinant plasmid construction of S.flexneri OmpA gene

2.2 OmpA的表達檢測與蛋白的純化、復(fù)性

將檢測成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達菌株E.coliBl21，獲得OmpA表達菌株，經(jīng)IPTG誘導后，蛋白電泳獲得約57ku條帶，其中包含OmpA蛋白約37ku，以及pET-32a質(zhì)粒的融合蛋白標簽20.4 ku。蛋白電泳結(jié)果顯示OmpA重組蛋白大小與理論預(yù)期數(shù)值一致。此外，利用SDS-PAGE電泳切膠純化，以及尿素濃度梯度復(fù)性的方法獲得OmpA蛋白（圖2）。

2.3 OmpA蛋白抗血清效價檢測

將OmpA蛋白免疫小鼠，獲得的抗血清經(jīng)酶聯(lián)法檢測，發(fā)現(xiàn)其抗體效價達到1∶1 600（圖3）。

2.4 OmpA蛋白抗血清特異性檢測

采用Western blot方法發(fā)現(xiàn)不同稀釋度OmpA抗血清出現(xiàn)明顯條帶；而對照陰性抗血清無對應(yīng)條帶（圖4）。表明OmpA抗血清可與OmpA蛋白特異性結(jié)合。

圖2 OmpA蛋白表達、純化與復(fù)性Fig.2 The expression，purification and renaturation of OmpA protein

圖3 OmpA多克隆抗體效價的檢測Fig.3 Detection of the OmpA polyclonal antibody titer

2.5 OmpA蛋白的氨基酸序列分析

利用DNA Man軟件，對選取的10種致病性菌株OmpA蛋白的氨基酸序列進行同源性分析。結(jié)果表明：不同細菌OmpA蛋白的C-端存在較高的同源性；不同種的志賀菌，如福氏志賀菌，痢疾志賀菌（Shigelladysenteriae），宋內(nèi)志賀菌（Shigellasonnei），鮑氏志賀菌（Shigellaboydii）存在更高的同源性（圖5）。

采用MEGA5.02軟件構(gòu)建的OmpA系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)四種志賀菌的親緣關(guān)系較近，福氏志賀菌與痢疾志賀菌親緣關(guān)系更近；動物致病菌副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurellamultocida）親緣關(guān)系近。

圖4 Western blot檢測OmpA多克隆抗體特異性Fig.4 Identification of the specificity of OmpA polyclonal antibodies by Western blot

3 討論

志賀菌是細菌性痢疾最常見的病原菌，分為福氏志賀菌，痢疾志賀菌，宋內(nèi)志賀菌，鮑氏志賀菌［11］。其中福氏志賀菌屬于高度傳染性的急性腸道傳染病，其通過侵襲并穿透黏膜，破壞結(jié)腸上皮層，引起細菌性痢疾［1-2］。OmpA蛋白在介導福氏志賀菌黏附侵染宿主細胞，以及誘導宿主的機體免疫上起到重要作用。研究證實OmpA的突變改變福氏志賀菌膜的結(jié)構(gòu)，從而減弱其毒力，影響細菌對宿主的黏附［6］。此外，OmpA免疫小鼠可顯著增加小鼠特異性的抗體水平，提高機體對福氏志賀菌的抵抗能力［7］。而獲得抗體是OmpA功能與作用研究的重要手段。多克隆抗體以其成本低、周期短及效果好得到廣泛運用［12］。本試驗利用分子與免疫學方法獲得OmpA蛋白原核表達載體，純化OmpA蛋白，并成功制備多克隆抗體，為揭示OmpA蛋白功能及相關(guān)疾病的發(fā)生機制研究奠定基礎(chǔ)。

OmpA蛋白具有重要的生物學功能，在遺傳進化上具有相對保守性。本試驗對OmpA序列系統(tǒng)發(fā)生分析研究發(fā)現(xiàn)不同種的致病菌存在同源性，特別C-端同源性較高，可能與其執(zhí)行重要的生理學功能有關(guān)；并且不同種志賀菌具有更高的同源性。因而，其免疫宿主產(chǎn)生的抗血清可能對不同種類致病菌具有交叉免疫保護作用，為OmpA蛋白疫苗的研制提供依據(jù)。

圖5 OmpA蛋白氨基酸序列比對Fig.5 Multiple alignment of amino acid sequences of OmpA protein

圖6 MEGA軟件構(gòu)建的OmpA氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on OmpA amino acid sequences by MEGA

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