鄭瑋璐，劉為民，陳 芳，王丙云＊，梁梓森，計(jì)慧琴，謝瑩佳

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

早孕因子（early pregnancy factor，EPF）是哺乳動(dòng)物受精后最早在血清中檢測(cè)到的具有免疫抑制和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的妊娠相關(guān)蛋白［1-2］。國(guó)外學(xué)者通過(guò)玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)（RIT）在妊娠小鼠血清中檢測(cè)到早孕因子的活性，因?yàn)槠湓缭谛∈笫芫?h～6h即可被檢測(cè)到，將其命名為早孕因子［3］。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠婦女以及羊、豬、牛、馬和兔等妊娠母體血清中也檢測(cè)到了EPF活性。

EPF是一種糖蛋白，耐透析、對(duì)酸堿度的耐受性較強(qiáng)，溫度低于56℃時(shí)很穩(wěn)定，但超過(guò)72℃時(shí)容易失活，EPF無(wú)動(dòng)物品種特異性［4］。人、豬和牛EPF的氨基酸序列完全相同，分子質(zhì)量均為10.93 ku，等電點(diǎn)約為6.5。EPF對(duì)妊娠具有很高的特異性，是最早確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一［5-6］。研究表明，小鼠交配后6h，兔交配后16h，大鼠、綿羊、牛、豬交配后24h即可從母體內(nèi)測(cè)出EPF，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于人絨毛膜促性腺素（hCG），而且EPF的活性在妊娠期存在時(shí)間較長(zhǎng)，在小鼠可持續(xù)至產(chǎn)仔前4d，綿羊、豬則幾乎持續(xù)整個(gè)孕期，直至分娩結(jié)束，并且豬懷孕3周～4周時(shí)EPF活性最高，但卵子如不受精則測(cè)不出［7］，EPF對(duì)人和動(dòng)物的超早期妊娠診斷具有重要意義。除了妊娠婦女以及羊、豬、牛、馬和兔等妊娠哺乳動(dòng)物母體血清中能檢測(cè)到EPF活性之外，一些學(xué)者們還在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了EPF，并且證實(shí)其有促細(xì)胞生長(zhǎng)的功能［8-9］。本研究從人腫瘤細(xì)胞系Hela細(xì)胞成功克隆到EPF基因，嘗試采用原核表達(dá)方法獲得大量EPF，為進(jìn)一步制備EPF單克隆抗體和開發(fā)母豬早孕檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒 大腸埃希菌BL21（DE3）、Hela細(xì)胞均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)；基因工程菌大腸埃希菌DH5α、pREST-A質(zhì)粒由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和材料 Premix ExTaq、XhoI、EcoRI、DNA Marker均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；低分子質(zhì)量蛋白Marker、DNA凝膠回收試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；NC膜、脫脂奶粉、BSA、丙烯酰胺，亞甲叉丙烯酰胺、甘氨酸、AP、Amp、咪唑、Tris base、透析袋等為北京鼎國(guó)公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、酵母提取物（Yeast Extract）為 OXOID公司產(chǎn)品；一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝為北京天恩澤產(chǎn)品；兔抗人EPF抗體、HRP羊抗兔二抗、HRP驢抗羊二抗為Proteintech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞的培養(yǎng) 凍存的Hela細(xì)胞置于水浴鍋中37℃快速解凍復(fù)蘇，離心洗滌后重懸細(xì)胞，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度到達(dá)80%～90%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代，選用第3代細(xì)胞抽提RNA，備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 用Primer5.0對(duì)Gen-Bank上已經(jīng)發(fā)表的EPF基因（CR407688）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，在引物的5′端加入XhoⅠ、EcoRⅠ 酶切位點(diǎn)（下劃線部分），設(shè)計(jì)時(shí)加入保護(hù)性堿基。引物序列如下：

引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為309bp。

1.2.3 RT-PCR 參照TaKaRa公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系如下：向4μL 5×AMV buffer中加入10mmol／L 的 dNTP 2μL，RNA 酶抑制劑1μL，Oligo（dT）1μL，AMV 1μL，模板RNA 11μL，反應(yīng)總體積20μL，離心混勻后，42℃作用1h。獲得的cDNA作為模板進(jìn)行PCR。在 PCR管中依次加入：Premix ExTaq酶12.5μL，模板DNA 1μL，10μmol／L的EPF-1和10μmol／L的EPF-1各1μL，滅菌的雙蒸水9.5μL，使反應(yīng)體系總體積為25μL。PCR反應(yīng)條件 ：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃45s，循環(huán)30次；72℃10 min。采用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)EPF基因的擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 將純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pREST-A分別用XholⅠ和EcoRⅠ雙酶切。將獲得的雙酶切產(chǎn)物與已雙酶切純化后的pREST-A在16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR，將鑒定為陽(yáng)性的克隆菌落進(jìn)行挑菌過(guò)夜培養(yǎng)，小量制備質(zhì)粒，經(jīng)酶切分析與測(cè)序鑒定。

1.2.5 組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)載體pREST-A轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），用1.0 mmol／L IPTG誘導(dǎo)，37℃恒溫?fù)u床200r／min振蕩培養(yǎng)5h。將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌進(jìn)行離心，12 000 r／min 10min，收集沉淀，PBS洗滌兩次，再將沉淀用PBS（10%原液體積）重懸。于冰浴中超聲波裂解細(xì)菌，裂解至菌液變清亮，12 000r／min離心20 min，分別收集上清和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況和可溶性，大量培養(yǎng)細(xì)菌，用于重組蛋白的純化。

1.2.6 重組蛋白的純化 按照一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行純化，收集洗脫液。采用脫鹽柱去除洗脫液中的鹽離子和多余水分子，采用PEG2000對(duì)脫鹽后的目的蛋白進(jìn)一步透析濃縮。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定獲得的蛋白濃度，以SDS-PAGE法測(cè)定目的蛋白的純度，用Wes tern blot檢測(cè)蛋白的抗原特異性。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 純化后的蛋白加入上樣緩沖液水沸煮5min后電泳；200mA恒流電轉(zhuǎn)；結(jié)束后，將NC膜用PBST洗3×5min；而后加入一抗37℃溫育2h，PBST洗3×5min，加入酶標(biāo)二抗，37℃溫育1h，取出用PBST洗3×5min；DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 EPF-cDNA的RT-PCR克隆

以Hela細(xì)胞總RNA為模板對(duì)EPF mRNA全長(zhǎng)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增出長(zhǎng)約309bp的條帶，與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小一致（圖1）。

圖1 EPF目的片段PCR產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR products of EPF genes

2.2 重組表達(dá)載體pREST-A-EPF的雙酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶XholⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組表達(dá)載體pREST-A-EPF進(jìn)行雙酶切，其中一條大小約為2 897bp，與pREST-A載體分子質(zhì)量大小一致，另一條大小約309bp，與EPF cDNA大小相符（圖2）。測(cè)序結(jié)果與目的片段同源性為100%。

2.3 目的蛋白的表達(dá)

將IPTG 誘導(dǎo)的 搖菌 過(guò)夜 的 BL21（DE3）-pREST-A-EPF菌液和BL21（DE3）-pREST-A菌液用SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示，搖菌過(guò)夜的連接載體表達(dá)菌液出現(xiàn)特異條帶，條帶大小約為16 ku，與預(yù)期蛋白大小相符，而搖菌過(guò)夜的空載體表達(dá)菌液沒(méi)有此特異性條帶（圖3）。

圖2 重組表達(dá)載體pREST-A-EPF酶切鑒定Fig.2 Identication of recombinant pREST-A-EPF plasmid by enzyme digestion

圖3 重組蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protien

將搖菌過(guò)夜的BL21（DE3）-pREST-A-EPF菌液于超聲波裂解，分別取上清和沉淀用SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示，重組目的蛋白主要以可溶性形式表達(dá)（圖4）。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化

用HIS標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白。純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果表明，得到純度高的融合蛋白，其分子質(zhì)量約為16ku，與預(yù)期相符（圖5）。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blot檢測(cè)

將純化的重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，純化的重組蛋白能被抗EPF抗體識(shí)別，并發(fā)生特異性結(jié)合（圖6）。

圖4 菌體超聲裂解產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE analysis of bacterial ultrasound pyrolysis product

圖5 純化的重組EPF蛋白SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant EPF protein

圖6 純化的重組EPF蛋白Western blot檢測(cè)Fig.6 Western blot analysis of purified recombinant EPF protein

3 討論

Morton H等［10］運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了重組EPF，采用真核表達(dá)系統(tǒng)制備重組EPF，并通過(guò)玫瑰花環(huán)抑制試驗(yàn)證明了重組EPF的活性與天然EPF活性相當(dāng)，無(wú)明顯差別［11］。也有通過(guò)原核表達(dá)成功獲得EPF的報(bào)道［12-14］。這些研究成果為解決從血清中分離EPF的難題提供了新的途徑與方法。

本試驗(yàn)采用的pRSET-A原核表達(dá)系統(tǒng)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①pRSET-A質(zhì)粒帶有34個(gè)氨基酸前導(dǎo)肽序列的融合標(biāo)簽，為小多肽融合標(biāo)簽，在大多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響很小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，因而多肽融合標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為實(shí)用；②該質(zhì)粒帶有His6-tag，可以采用His柱親和層析法對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，該方法不使蛋白質(zhì)變性，最大限度地保留目的蛋白的免疫原性。在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度低于0.05mmol／L時(shí)細(xì)菌仍能表達(dá)目的蛋白，并且還發(fā)現(xiàn)無(wú)需IPTG誘導(dǎo)，只要搖菌37℃過(guò)夜，也能得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳和 Wes tern blot分析證實(shí)為目的蛋白。分析出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能原因：①pRSET-A原核表達(dá)系統(tǒng)受lacO的調(diào)控，而lacO本身不是嚴(yán)謹(jǐn)操縱子，所以出現(xiàn)了泄漏表達(dá)；②在培養(yǎng)基中會(huì)含有一些乳糖的成分，導(dǎo)致本底表達(dá)。因?yàn)檫@不是本試驗(yàn)的內(nèi)容，所以不做進(jìn)一步研究。將表達(dá)細(xì)菌體經(jīng)超聲波破碎后，離心收集上清和沉淀，通過(guò)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白存在上清中，為可溶性蛋白。以可溶形式表達(dá)的目的蛋白，具有天然的四級(jí)結(jié)構(gòu)，能夠保持目的蛋白的天然構(gòu)象，從而可以簡(jiǎn)化目的蛋白的純化，減少純化過(guò)程中目的蛋白的損失。

母豬妊娠診斷技術(shù)的趨勢(shì)是向著診斷時(shí)間早、診斷準(zhǔn)確率和靈敏度高的方向發(fā)展。所以，母豬超早期妊娠診斷的價(jià)值很大，對(duì)確診已妊娠的母豬，保證胎兒正常發(fā)育，防止流產(chǎn)以及預(yù)測(cè)分娩日期；對(duì)未妊娠的母豬，可以及時(shí)進(jìn)行檢查，找出未孕原因，采取相應(yīng)的治療措施，能有效地提高母豬繁殖效率和減少經(jīng)濟(jì)損失［15-16］。而EPF作為具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性的妊娠相關(guān)蛋白，是最早確認(rèn)妊娠的生化指標(biāo)之一，在超早期妊娠診斷中有著至關(guān)重要的檢測(cè)意義和應(yīng)用價(jià)值。

研究證明，EPF無(wú)動(dòng)物以及品種特異性［17］，而且人和豬的EPF的氨基酸序列完全相同［11］。所以，本研究獲得的重組人EPF蛋白同樣適用于對(duì)EPF蛋白的相關(guān)研究以及母豬早孕診斷試劑盒的開發(fā)。

［1］溫志鋒，練玉銀，王家驥，等.早孕因子分離純化方法的優(yōu)化［J］.免疫學(xué)雜志，2012，28（12）：1073-1076.

［2］王乃東，薛立群.早孕因子的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（4）：5-8.

［3］Morton H，Hegh V，Clunie G J A.Immunosuppression detected in pregnant mice by the rosette inhibition test［J］，Nature，1974，249：456-459.

［4］Corrao S，Campanella C，Anzalone R，et al.Human Hsp10 and Early Pregnancy Factor（EPF）and their relationship and involvement in cancer and immunity：current knowledge and perspectives［J］.Life Sci，2010，86（5-6）：145-152.

［5］楊 杰，張海濤，翟 頻，等.早孕因子多克隆抗體的制備及應(yīng)用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（6）：321-324.

［6］Campbell K L，Rockett J C.Biomarkers of ovulation，endometrial receptivity，fertilisation，implantation and early pregnancy progression［J］.Paediatr Perinat Epidemiol，2006，20（S1）：13-25.

［7］王曉申，魏麗軍，葉紹輝.早孕因子研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2008（2）：313-316.

［8］鄧松華，蘇寶田，徐振山.早孕因子對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，1998，14（4）：410-413.

［9］杜曉明.人早孕因子表達(dá)與促細(xì)胞生長(zhǎng)模型的初步建立［D］.河南鄭州：鄭州大學(xué)，2011.

［10］Morton H，Mckay D A，Murphy R M，et al.Production of a recombinant form of early pregnancy factor that can prolong allogeneic skin graft survival time in rats［J］.Immunol Cell Biol，2000，78（6）：603-607.

［11］Somodevilla-Torres M J，Morton H，Zhang B，et al.Purification and characterisation of functional early pregnancy factor expressed in sf9insect cells and in escherichia coli［J］.Protein Expr Purif，2003，32（2）：276-287.

［12］杜曉明，張改平，王 麗，等.重組人早孕因子的表達(dá)與純化［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（14）：40-44.

［13］練玉銀，王家驥.重組早孕因子（EPF）的表達(dá)、純化及鑒定［J］.生殖與避孕，2012，32（3）：156-160.

［14］王 麗，杜曉明，王林林，等.人熱休克蛋白10和鼠熱休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表達(dá)［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26（3）：56-59.

［15］邊艷超，劉 穎，王 未，等.家畜早期妊娠診斷技術(shù)研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2014（8）：100-102.

［16］張宏剛，陳樹林，王曉珊，等.孕牛血清早孕因子的生物活性檢測(cè)及妊娠率分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（8）：30-33.

［17］Ghaffari L V，Ghaffari L R，Pirany N，et al.Measurement of EPF for detection of cow pregnancy using rosette inhibition test［J］.Theriogenology，2008，70（1）：105-107.