彭 凌，楊旭夫，朱必鳳，劉博婷

（韶關(guān)學(xué)院粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，英東生命科學(xué)學(xué)院，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病診斷中心聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東韶關(guān) 512005）

豬鏈球菌（Streptococcussuis，SS）是一種重要的人獸共患病病原體，多年來(lái)一直困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，按其莢膜抗原的差異，可分為35個(gè)血清型（1～34及1／2），對(duì)豬致病性較強(qiáng)的血清型是1型、2型、1／2型、7型和9型［1］。癥狀主要為腦膜炎和敗血癥，發(fā)病率和病死率均較高，少數(shù)育肥豬則以關(guān)節(jié)炎型為主要特征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)相關(guān)從業(yè)人員的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。2005年6月～7月份發(fā)生在四川省資陽(yáng)、內(nèi)江等地區(qū)的2型豬鏈球菌感染事件造成了一定的社會(huì)影響和極大的經(jīng)濟(jì)損失，引起廣泛關(guān)注［2］。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病，但隨著抗菌藥物的廣泛使用及不合理用藥，使得病原菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重［3-4］。本試驗(yàn)從廣東某豬場(chǎng)采集具有臨床癥狀的病死豬的關(guān)節(jié)液，其中的優(yōu)勢(shì)病原菌疑為豬鏈球菌的病原菌，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16SrRNA序列分析、豬鏈球菌2型的毒力基因檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)，為控制該病的發(fā)生與流行提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料來(lái)源于廣東韶關(guān)某一豬場(chǎng)，豬群表現(xiàn)為患豬體溫升高，被毛粗亂，一肢或四肢關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，有跛行，嚴(yán)重者不能起立。無(wú)菌采取病死豬的關(guān)節(jié)液等病變組織涂布于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察。

1.1.2 主要試劑 各類生化反應(yīng)管、藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、TaKaRaTaqenzyme為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將無(wú)菌采集的新鮮關(guān)節(jié)液涂布于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)。挑取直徑1.0mm、半透明、圓形光滑的菌落接種于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純化。挑取純培養(yǎng)物的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。

1.2.2 生化鑒定 從分離得到的菌株的純培養(yǎng)物中挑取單個(gè)典型菌落，按照杭州天和微生物試劑有限公司反應(yīng)管說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 基因組DNA的提取 取適量的培養(yǎng)物離心收集菌體，沉淀物加入567μL的TE緩沖液重懸，加入30μL 100g／L的SDS和3μL 20mg／mL的蛋白酶K，振蕩充分混勻，于37℃水浴鍋中溫育1h，直到溶液變得透明為止。加入100μL 5mol／L NaCl，充分混勻，再加入80μL CTAB／NaCl溶液，混勻，于65℃溫育10min；加入等體積的酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）混勻，10 000×g離心5min，取上清，再用酚／氯仿／異戊醇抽提1次；加入0.6倍體積的異丙醇（約450μL），輕輕混合，經(jīng)10 000×g離心10min，棄上清，沉淀用700mL／L乙醇洗滌2次，重溶于TE緩沖液中，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 1 6SrRNA序列測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［5-6］設(shè)計(jì)豬鏈 球 菌 16SrRNA 基 因 擴(kuò) 增 引 物，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1 500bp，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系（總體積為25μL）含：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.3），10mmol／L KCl，2.5mmol／L MgCl2，0.4mmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，基因組DNA 100ng，Taq酶1.5U。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃5min；94℃30s，50℃1min，72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃6min。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序引物同PCR擴(kuò)增引物，雙向測(cè)通。序列測(cè)定后，通過(guò)DNA Star 7.1軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行校對(duì)分析，建立完整可靠的序列，并通過(guò)采用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast程序與已知序列進(jìn)行相似性分析，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.5 PCR分型鑒定 根據(jù)文獻(xiàn)［7］合成對(duì)豬鏈球菌2型莢膜多糖（cps2J）特異性引物，cps2J-s：5′-GTTGAGTCCTTATACACCTGTT-3′，cps2J-as：5′-CAGAAAATTCATATTGTCCACC-3′。預(yù)期擴(kuò)增出的目的基因片段長(zhǎng)度為459bp。反應(yīng)體系（總體積為25μL）含：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.3），10mmol／L KCl，2.5mmol／L MgCl2，0.4mmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，基因組 DNA 100ng，Taq酶1.5U 。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35個(gè)循 環(huán)；72 ℃6min。擴(kuò)增產(chǎn)物用14g／L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用Master VDS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法將純化豬鏈球菌菌液調(diào)整濁度與比濁管（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬┫嗤?，用滅菌棉簽均勻涂布于血平板上?7℃培養(yǎng)24h后，并用美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定［8］。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離

從采集的病料中分離得到3株革蘭陽(yáng)性球菌，分別將其編號(hào)為SG1、SG2、SG3。分離菌株在血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上均呈半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色狀的小菌落；鏡檢呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列的革蘭陽(yáng)性球菌。

2.2 生化試驗(yàn)

對(duì)分離到的3株革蘭陽(yáng)性球菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，3個(gè)菌株生化試驗(yàn)結(jié)果一致，均可發(fā)酵乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖和七葉苷，不發(fā)酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水楊苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油。生化反應(yīng)結(jié)果符合豬鏈球菌的生化特性。

2.3 16SrRNA序列測(cè)定

通過(guò)16SrRNA的PCR擴(kuò)增，3個(gè)菌株均擴(kuò)增出1 500bp左右的目的片段，且產(chǎn)物濃度高，無(wú)非特異性雜帶，與預(yù)期結(jié)果一致，可用于純化測(cè)序。具體電泳結(jié)果見圖1。

圖1 16SrRNA片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of 16SrRNA gene fragment

將測(cè)序公司的原始數(shù)據(jù)通過(guò)DNA Star 7.1軟件處理和校對(duì)，3株菌測(cè)得有效序列1 393bp，菌株之間存在5個(gè)堿基突變位點(diǎn)。將所得菌株的1 6S rRNA基因序列在NCBI上用Blast進(jìn)行同源性比較，結(jié)果基因同源性達(dá)99%以上的參考菌株全為SS。與湖南長(zhǎng)沙的JX207110和JX207111SS參考株關(guān)系最近，與分離株SG1、SG2、SG3的基因同源性分別為99.7%、99.8%、100%。進(jìn)一步確定該細(xì)菌為SS。

2.4 PCR分型鑒定

用豬鏈球菌2型Cps2J引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得459bp大小的目的片段（圖2），與預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段的分子質(zhì)量一致。

圖2 Cps2J片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of Cps2Jgene fragment

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3株菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本表現(xiàn)一致，均表現(xiàn)對(duì)頭孢氨芐、頭孢拉定、先鋒Ⅴ、左氟沙星高度敏感；先鋒噻肟、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩若沙星、頭孢呋肟、氟哌酸、氯霉素、利福平、洛美沙星、氟羅沙星中度敏感；呋喃妥因、多西環(huán)素、阿莫西林、復(fù)方新若明、林可霉素、克拉霉素、卡那霉素、痢特靈、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、阿米卡星、依諾沙星、氨芐青霉素、羧芐青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、羅紅霉素、甲氧胺嘧啶、青霉素G等21種藥物不敏感。

3 討論

本研究從廣東某發(fā)病豬場(chǎng)的發(fā)病豬關(guān)節(jié)液分離到3株革蘭陽(yáng)性球菌，生化試驗(yàn)鑒定為豬鏈球菌，將所得菌株的16SrRNA基因序列在NCBI上用Blast進(jìn)行同源性比較，結(jié)果基因同源性達(dá)99%以上的參考菌株全為SS。16SrRNA基因具有高度的保守性和特異性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類和鑒定［9-13］。根據(jù)不同屬細(xì)菌16SrRNA基因同源性為70%～90%，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性＞99%［14］，從分子水平確定這3株細(xì)菌為豬鏈球菌。為進(jìn)一步確定這3株菌的型別，我們采用已報(bào)道的擴(kuò)增豬鏈球菌2型莢膜多糖的特異性引物對(duì)它們進(jìn)行鑒定，結(jié)果這3株菌均擴(kuò)增出預(yù)期的459bp的預(yù)期片段。

近年來(lái)，由于抗生素的濫用，產(chǎn)生了大量耐藥菌株，抗生素也失去應(yīng)有的作用，疾病難以控制；其次，豬鏈球菌具有較強(qiáng)的地域性，即使同一地區(qū)的不同菌株也有明顯的差異，因此在用藥前應(yīng)做藥敏試驗(yàn)來(lái)確定敏感藥物。為指導(dǎo)臨床用藥，本試驗(yàn)選用目前常用的35種藥物對(duì)分離到的3株豬鏈球菌進(jìn)行了藥物試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)分離菌株對(duì)頭孢菌素類、喹諾酮類、氯霉素類藥物表現(xiàn)出敏感，而對(duì)青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、林可胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類等21種抗生素表現(xiàn)出耐藥，耐藥性相當(dāng)嚴(yán)重，應(yīng)引起養(yǎng)殖戶的高度重視。

理論上很多藥物對(duì)鏈球菌有療效。但近年來(lái)由于抗生素的濫用，如在動(dòng)物飼料中長(zhǎng)期添加抗生素用于促進(jìn)生長(zhǎng)及預(yù)防和治療疾病，發(fā)生疾病后未經(jīng)獸醫(yī)診斷就盲目大量使用多種抗生素等，不僅治療成本提高，而且產(chǎn)生了大量耐藥菌株，使得疾病難以控制。臧瑩安等［3］對(duì)豬鏈球菌廣東分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，85%菌株對(duì)阿莫西林等藥敏感，45%菌株對(duì)先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素 Ⅵ 等中度敏感，85% 以上的菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、氯霉素類、喹諾酮類、林可胺類和四環(huán)素類等不敏感。黃文明等［4］對(duì)豬鏈球菌廣東分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)四環(huán)素類、磺胺類和氨基糖苷類抗菌藥物表現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性，尤其對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥率高達(dá)98.2%；對(duì)頭孢菌素類藥物比較敏感。本文豬鏈球菌廣東分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與以上不盡相同，分析原因可能與各豬場(chǎng)用藥習(xí)慣不同，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性不同有關(guān)。建議豬場(chǎng)在防治豬鏈球菌病時(shí)，應(yīng)在確診的基礎(chǔ)上，通過(guò)藥敏試驗(yàn)，有目的、有針對(duì)性地用藥，避免濫用抗生素，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選用用2種～3種敏感藥物交替用藥，避免菌株耐藥性的增強(qiáng)，盡量減少耐藥菌株產(chǎn)生。

［1］何孔旺，倪艷秀，王繼春.豬鏈球菌2型的分子流病學(xué)研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，2002（5）：45.

［2］郝春燕，王利勤，王晶鈺.豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（5）：124-128.

［3］臧瑩安，盧 頓，胡 波，等.廣東地區(qū)發(fā)病豬群豬鏈球菌感染監(jiān)測(cè)及藥敏試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（12）：73-75.

［4］黃文明，歐陽(yáng)昀，張民澤，等.廣東地區(qū)豬鏈球菌的耐藥性特點(diǎn)及四環(huán)素耐藥基因攜帶情況［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（5）：54-58.

［5］William G，Susan M B，Dale A P，et al.16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study［J］.J Bacteriol，1991，173（2）697-703.

［6］蘇 良，歐新華，楊柳青，等.豬鏈球菌長(zhǎng)沙分離株的鑒定與16SrRNA系統(tǒng)進(jìn)化分析［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013，29（6）：547-550.

［7］Marois C，Bougeard S，Gottschalk M，et al.Multiplex PCR assay for detection ofStreptococcussuisspecies and serotypes 2 and 1／2in tonsils of live and dead pigs［J］.J Clin Microbiol，2004，42（7）：3169-3175.

［8］CLSI／NCCLS document M100-S22（ISBN 1-56238-786-3），Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，twenty-second informational supplement［S］.

［9］陳 煜，吳 達(dá)，孫 敏，等.一株豬源豕鏈球菌的分離鑒定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：219-223.

［10］黃平容，田世成，蘇建明.一株耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌的分離鑒定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（6）：81-84.

［11］Claire J，Clare L L，Holly L C，et al.Detection and identification of bacteria in clinical samples by 16SrRNA gene sequencing：comparison of two different approaches in clinical practice［J］.J Med Microbiol，2012，61（4）：483-488.

［12］Christian F P S，Knud P，Mogens K，et al.Novel molecular method for identification of Streptococcus pneumoniae applicable to clinical microbiology and 16SrRNA sequence-based microbiome studies［J］.J Clin Microbiol，2012，50（6）：1968-1973.

［13］Kirstin J E，Julie M J L，Sally L，et al.Utility of real-time amplification of selected 16SrRNA gene sequences as a tool for detection and identification of microbial signatures directly from clinical samples［J］.J Med Microbiol，2012，61（5）：645-652.

［14］沈德新，封志純.核糖體核糖核酸基因簇在細(xì)菌系統(tǒng)分類中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2004，10（2）：69-71.