潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長因子在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及其臨床意義

潘海英，王紅靜，徐 盼，楊凌云，賈西彪，陳 靜，陳 岑

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

目的 探討在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)在子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)中的表達及其臨床意義。方法 選擇2013年9 月至2014年3月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院行手術(shù)治療的EMS患者39例(A組)，其中疼痛22例(A1組)，無疼痛17例(A2組)。選擇同期因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)III行子宮切除的24例患者作為對照(B組)。采用免疫組化法檢測各組子宮在位內(nèi)膜中NGF的表達。結(jié)果 NGF在A組及B組在位子宮內(nèi)膜上均有陽性表達，但A組、A1組NGF的表達均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組表達明顯高于A2組(P< 0.05)，而A2與B組比較表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 EMS患者在位子宮內(nèi)膜 NGF表達增加，伴有疼痛者更明顯。NGF可能參與了EMS疼痛的發(fā)生。

子宮內(nèi)膜異位癥；神經(jīng)生長因子；疼痛

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)簡稱內(nèi)異癥，是子宮外含有子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)的雌激素依賴性病變，始于細胞水平而止于盆腔疼痛和不孕[1]。80%的EMS患者有慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)，主要表現(xiàn)為經(jīng)期或經(jīng)前后出現(xiàn)的腹痛、腰骶部疼痛，甚至劇痛難忍，嚴重影響患者生活質(zhì)量和身心健康。EMS的發(fā)病機制至今尚不明確。近年來，越來越多的研究顯示EMS疼痛與在位內(nèi)膜神經(jīng)纖維密度有關(guān)。神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)在誘導(dǎo)及維持神經(jīng)纖維生長中起著重要的作用，而其中的在位子宮內(nèi)膜神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是產(chǎn)生疼痛及痛覺過敏的關(guān)鍵因素[2]，由此推測NGF可能與EMS患者的疼痛有關(guān)。本研究擬通過免疫組化法檢測NGF在EMS在位內(nèi)膜的表達，了解其在EMS疼痛發(fā)生中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年9月至2014年3月在四川大學(xué)華西第二醫(yī)院經(jīng)手術(shù)病理證實為EMS且同意術(shù)中同時行診刮術(shù)的39例患者(A組)，其中疼痛22例(A1組)和無疼痛17例(A2組)，A1組年齡22～49歲[(34.3±4.1)歲]，A2組年齡24～47歲[(35.7±6.3歲))。選擇同期因CINIII行子宮切除的24例患者作為對照(B組)，年齡20～45歲[(31.3±5.1歲)]。A組排除子宮腺肌癥和術(shù)前3月內(nèi)接受過激素治療的患者，B組排除EMS、子宮腺肌癥和術(shù)前3月內(nèi)接受過激素治療的患者。A1、A2和B組在孕產(chǎn)次、年齡、月經(jīng)周期等方面比較成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，A1組和A2組在手術(shù)分期分布上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。

1.2 方法 分別提取病例組在位內(nèi)膜組織和對照組在位內(nèi)膜組織的石蠟切片，制成4 μm厚切片。采用免疫組化辣根過氧化物酶(HRP)-二甲基聯(lián)苯胺(DAB)檢測顯示系統(tǒng)分析A，B兩組中NGF的表達情況。試劑一抗多克隆兔抗人NGF抗體(工作濃度1∶100)購自北京希美杰生物技術(shù)有限公司。免疫組化SP試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。用小鼠腦組織作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。用倒置生物顯微鏡觀察切片，并對圖像進行采集。

1.3 結(jié)果判定 參照Shimizu等[3]的免疫組化評分方法，進行半定量評分。顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野(×200)，綜合細胞染色強度及陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比，進行半定量分析。染色強度評分標準：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，5%～為1分，25%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。每張切片讀取5個視野的平均值，將細胞染色強度計分和陽性細胞比例計分相加，作為最后積分。根據(jù)最后積分，≤1分為陰性(-)，>1分且≤3分為弱陽性(+)，>3分且≤5分為陽性(++)，>5分為強陽性(+++)。EMS手術(shù)分期參照美國生育協(xié)會提出的“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法(1997年)”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

NGF在A組及B組在位子宮內(nèi)膜上均有不同程度表達。陽性顆粒主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的胞漿和胞膜。A組、A1組、A2組和B組NGF表達陽性率分別為76.9%、95.5%、52.9%和45.8%，其中A組、A1組均明顯高于B組(P< 0.05)，A1組明顯高于A2組(P< 0.05)。A2與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表1及圖1。

表1 不同分組NGF的表達

#A組與B組比較；## A1組與B組比較；### A1組與A2組比較；#### A2組與B組比較

3 討論

EMS病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不清楚，目前推測神經(jīng)機制可能在其發(fā)病中起著重要作用[4]。有研究顯示內(nèi)異癥是一種混合炎癥、神經(jīng)性疼痛的病癥[5]。Stratton 等[6]通過電子數(shù)據(jù)庫檢索1967年后報道的疼痛婦女的臨床基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)膜異位病灶可以誘發(fā)自己的神經(jīng)支配，從而產(chǎn)生病變與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的直接和雙向互動聯(lián)系。

圖1 NGF在子宮內(nèi)膜的表達情況(DAB×200) a：NGF陰性表達；b：NGF弱陽性表達；c：NGF陽性表達；d：NGF強陽性表達

NT是一類由神經(jīng)所支配的組織(如肌肉)和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的且為神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質(zhì)分子，對神經(jīng)元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用。其中NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)因子，在神經(jīng)纖維的生長、維持中起著重要作用。正常人的子宮肌層、子宮內(nèi)膜與子宮肌層交界面及子宮內(nèi)膜基底層的深部都有神經(jīng)纖維支配，但子宮內(nèi)膜的上2/3無神經(jīng)纖維[7]。

EMS患者病灶內(nèi)的高神經(jīng)纖維分布與其神經(jīng)因子高表達相伴出現(xiàn)。McKinnon 等[8]檢測了EMS患者異位組織神經(jīng)纖維及腹腔液神經(jīng)因子濃度，結(jié)果顯示與EMS相關(guān)的疼痛和腹腔液神經(jīng)因子的濃度有關(guān)。Barcena[9]進行神經(jīng)營養(yǎng)因子的前瞻性臨床研究，比較了EMS、子宮腺肌病、盆腔粘連患者腹腔液中神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(Neurotrophin-3，NT-3)的濃度，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者腹腔液中NGF、BDNF的濃度明顯升高。Kajitani等[10]通過測定EMS患者與非EMS患者腹腔液中NGF的表達，發(fā)現(xiàn)EMS患者腹腔液中的NGF表達水平顯著高于常人水平。

我們研究了NGF因子在EMS與非EMS患者在位子宮內(nèi)膜上的表達，結(jié)果顯示：NGF在EMS患者在位內(nèi)膜的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中又尤以在EMS疼痛患者在位內(nèi)膜中的表達最高，高達95.5%，其明顯高于非疼痛組及對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。非疼痛組與對照組相比，NGF表達略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示NGF主要通過參與EMS的疼痛而參與EMS的發(fā)生。

NGF參與EMS疼痛發(fā)生的神經(jīng)機制可能與下列因素有關(guān)：NGF及其受體增加能促進感覺神經(jīng)纖維的增生。Arnold[11]報道內(nèi)異癥腹膜病灶中交感神經(jīng)纖維密度降低而感覺神經(jīng)纖維密度增加。Bokor等[12]研究顯示：小神經(jīng)纖維的密度在輕度子宮內(nèi)膜異位患者的子宮內(nèi)膜中與正常盆腔的患者相比高出14倍。NGF本身亦是一種疼痛介質(zhì)，能誘導(dǎo)與調(diào)控與中樞疼痛傳導(dǎo)有關(guān)的P物質(zhì)(Substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)及神經(jīng)絲(neurofilament，NF)的表達。腎上腺能神經(jīng)末梢釋放前列腺素E2，前列環(huán)素(prostacyclin，PGI2)，這些物質(zhì)能使感覺神經(jīng)C致敏[13]。作為重要的前列腺素合成限速酶的環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)能增加侵襲性、誘導(dǎo)血管形成，在內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜，其表達亦明顯增高，使之有助于內(nèi)膜細胞的粘附侵襲。這也符合我國學(xué)者提出的“在位內(nèi)膜決定論”。而EMS患者病灶中的神經(jīng)纖維可能即來源于在位內(nèi)膜功能層的神經(jīng)纖維，或是有活性的在位內(nèi)膜脫落后，種植在腹腔等其他部位時所分泌的能促進神經(jīng)生長的細胞因子如NGF。EMS腺體和血管附近有神經(jīng)生長因子受體p75(NGFRp75)陽性的神經(jīng)纖維表達，神經(jīng)生長因子通過EMS腺體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[14]。這提示腹膜子宮內(nèi)膜異位病灶可能受感覺神經(jīng)A、感覺神經(jīng)C、膽堿能和腎上腺素能神經(jīng)纖維支配。Barcena de Arellano等[15]比較EMS患者與其他婦科患者的腹腔液神經(jīng)元生長的體外模型和NGF的表達，發(fā)現(xiàn)EMS和子宮內(nèi)膜異位病灶的腹腔液具有親神經(jīng)性。EMS是激素依耐性疾病，雌二醇和孕激素均能刺激NGF在間質(zhì)細胞的表達，而使用孕激素后，NGF受體則明顯減弱[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)在EMS在位內(nèi)膜中有NGF表達，且疼痛患者中表達更顯著，提示NGF可能參與了EMS疼痛的發(fā)生。由此說明采用在位內(nèi)膜免疫組化標記NGF作為具有疼痛的EMS患者的篩查以及采用神經(jīng)因子拮抗阻斷治療EMS疼痛患者將是可行的。

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The expression of nerve growth factor and its significance in eutopic endometrium of patients with endometriosis

PAN Hai-ying，WANG Hong-jing，XU Pan，YANG Ling-yun，JIA Xi-biao，CHEN Jing，CHEN Cen

(West China Second Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

WANGHong-jing

Objective To investigate the expression of nerve growth factor(NGF)in eutopic endometrium of patients with endometriosis，and to explore the role of NGF in the development of endometriosis-associated pain.Methods A total of 63 patients underwent surgical were studied.Of these patients，39 underwent surgical endometriosis lesion excision(group A)in which 22 patients suffered from dysmenorrheal(group A1)and 17 patients had no dysmenorrheal(group A2).At the same time，24 patients undergone uterectomy because of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)were used as control group(group B).Immunohistochemistry was performed to detect the expression of NGF in eutopic endometrium.Results The level of NGF of endometrium in the group A and the group A1 were significantly higher than that in the group B(P< 0.05).The level of NGF in endometrium in the group A1 was significantly higher than that in the group A2(P< 0.05).There was no statistically significant difference in NGF expression between the group A2 and group B(P> 0.05).Conclusion NGF express in endometrium of patients with dysmenorrhea may participate in the pathogenesis of endometriosis and endometriosis associated pain.

Endometriosis；Nerve growth factor；Dysmenorrhea

四川省科技廳科技支撐基金資助項目(編號：2012 SZ0022)

王紅靜

R711.71

A

1672-6170(2015)05-0111-03

2015-01-30；

2015-05-27)