于衛(wèi)霞，劉曉玲，王敏強(qiáng)，趙明日，王家璇

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014)

基于線粒體DNA多態(tài)性鑒定煙臺(tái)海鮮市場(chǎng)魚種

于衛(wèi)霞1，劉曉玲1，王敏強(qiáng)1，趙明日1，王家璇2

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014)

由煙臺(tái)海鮮市場(chǎng)隨機(jī)采集具有相對(duì)重要商業(yè)價(jià)值的10種海魚(小黃魚、牙片、鲅魚、面條魚、鮐魚、鯧魚、鱸魚、偏口、黑魚、白姑魚)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)魚種進(jìn)行鑒定.首先提取10種海魚的基因組DNA，利用自行設(shè)計(jì)的通用引物對(duì)其線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅲ基因(MT-co3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆、測(cè)序，用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定了10種海魚的魚種.依據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析，選用NlaⅢ和HinfⅠ2種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，獲得了各種魚類特異的酶切片段圖譜.研究結(jié)果表明，PCR-RFLP能有效地區(qū)分以上10種海魚，在魚種鑒定上具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，可為魚類食品檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù).

聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù);物種鑒定;線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅲ基因;海魚

近年來(lái)，在海魚產(chǎn)品捕撈、加工處理、市場(chǎng)流通等環(huán)節(jié)中，以次充好、魚種標(biāo)簽混亂等問(wèn)題幾乎成為一個(gè)全球性的普遍現(xiàn)象［1-3］.在生活實(shí)踐中，人們一般依據(jù)形態(tài)特征等對(duì)魚種進(jìn)行鑒別［4］，但經(jīng)過(guò)加工尤其是深加工的產(chǎn)品則難以辨別其種類來(lái)源;而且由于所處生態(tài)環(huán)境、食物種類等方面的差異也可能造成魚類形態(tài)學(xué)上的差異，所以完全通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行種屬的鑒別非常困難［5-6］.目前對(duì)海洋食品物種鑒定方法主要有2種，一種是蛋白質(zhì)鑒定方法，另一種是基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法.相對(duì)于用蛋白質(zhì)對(duì)物種進(jìn)行鑒定，利用DNA技術(shù)進(jìn)行鑒定具有更高的特異性和靈敏度的可靠性［7］.該技術(shù)突破了對(duì)經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識(shí)背景的過(guò)度依賴，即便是對(duì)有機(jī)體殘片也可以進(jìn)行快速有效的鑒定.在DNA技術(shù)的分子生物學(xué)方法中，線粒體DNA(mtDNA)以其分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速度快、具有更好的耐熱性和相對(duì)高的豐度等成為海洋食品物種鑒定中首選［8］，其中應(yīng)用最為普遍的是細(xì)胞色素b基因(cyt b)，其次是16S rRNA和12S rRNA;在常用的分析技術(shù)中，列前2位的是PCR-RFLP和PCR-sequencing［9］.Hebert等［10-11］提出利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基(MT-co1)的特定區(qū)段做DNA條形編碼(DNA barcoding)的基礎(chǔ)，確定了其在動(dòng)物鑒定中的作用.Wolf等［12］利用PCR-RFLP鑒別出10種鱘魚中的8種;Haye等［13］利用MT-co1對(duì)智利市場(chǎng)上7種螃蟹制品進(jìn)行鑒別，發(fā)現(xiàn)一種螃蟹制品與其商品標(biāo)簽不符;李瀟等［7］用PCR-RFLP和芯片生物分析技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增cyt b基因片段，并用DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3種限制性內(nèi)切酶酶切分析，對(duì)渤海灣魚種進(jìn)行了鑒定;陳雙雄等［14］也用PCR-RFLP和芯片生物分析技術(shù)，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增cyt b基因片段的DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3種酶切圖譜分析，鑒定了臺(tái)灣海峽常見8種石斑魚品種和5種鯛魚品種;李新光等［15］以MT-co1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用基因克隆技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的冷凍魚、凍魚片和烤魚片進(jìn)行了鑒別.

本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得不同魚種的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ基因(cytochrome c oxidase subunitⅢ，MT-co3)及其旁側(cè)序列，通過(guò)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物擴(kuò)增各種海魚該基因，利用生物信息學(xué)技術(shù)、基因克隆、測(cè)序與PCR-RFLP技術(shù)對(duì)海魚種類進(jìn)行鑒別，旨在建立簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的魚肉制品的鑒定方法，為魚肉制品的溯源和安全監(jiān)管提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

于2013年5月和2014年5月，分別從煙臺(tái)市紅利市場(chǎng)和清泉寨市場(chǎng)購(gòu)買10種海魚，分別編號(hào)為1～10，每種魚隨機(jī)選取5尾，其本地的中文俗名見表1.每尾魚均經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，取其背部肌肉組織保存于75%的乙醇中備用.

表110 種海魚樣品Tab.1 10 species of marine fish

1.2 試劑

無(wú)水乙醇、氯仿、異戊醇(分析純)煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司;Tris-平衡酚(pH值8.0)北京索萊寶科技有限公司;10×Buffer緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs(2.5 mmol/L)、DNAMarker(DL2000)、100 bp Marker，天根生化科技(北京)有限公司; DH5α感受態(tài)細(xì)胞，自制;TA克隆試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司;蛋白酶K，德國(guó)Merck公司; Goldview核酸染料、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、NlaⅢ、HinfⅠ，天根生化科技(北京)有限公司.

1.3 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)HC-3018R安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;PCR儀德國(guó)Biometra公司;DYCP -31N水平電泳儀北京六一儀器廠;ZF1-Ⅱ紫外分析儀金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司.

1.4 方法

1.4.1 基因組DNA的提取采用常規(guī)的酚-氯仿法提取DNA，操作如下:取每尾海魚保存的背部肌肉組織約150 mg于1.5 mL EP管中，加入200 μL組織提取液(含Tris-HCl 10mmol/L.EDTA 100 mmol/L.SDS 0.5%)，用研杵充分研磨后，補(bǔ)加400 μL組織提取液，10 μL蛋白水解酶K(20 mg/mL)，充分混勻后50℃消化過(guò)夜，然后加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1，V/V)，置于冰袋上輕緩顛倒混勻10 min，4℃5 000 g離心6 min.吸取上清液至新的1.5 mL EP管，加等體積氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)，置于冰袋上輕緩顛倒混勻20 min，4℃5 000 g離心6 min.吸取上清液至新的1.5 mL EP管中，加入0.1～0.2倍體積2 mol/L的NH4Ac(pH值7.0)，再加入-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃保存1～4 h.4℃12 000 r/min離心10 min，棄去液體，加入70%乙醇600 μL，輕緩顛倒數(shù)次沖洗，4℃12 000 r/min離心5 min，棄去液體，37℃烘箱中烘干，加入100 μL TE溶解DNA，-20℃貯存?zhèn)溆?

1.4.2 通用引物設(shè)計(jì)從基因庫(kù)中查找到10種海魚中除高眼鰈、中間低鰭鯧外(截止2014年10月)的8種海魚的MT-co3序列，以及其他12種參照海魚魚種MT-co3序列.利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，在MT-co3兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，通用引物由上海生物工程服務(wù)有限公司合成，上游引物F:5’-TAATGGCCCATCAAGCACA-3’，下游引物R:5’-CTTTCCTTGGATTTTAACCAA-3’.

1.4.3 目的DNA片段PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及條件聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)采用25 μL體系，DNA模板1 μL，10×Taq Buffer2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，Taq DNA聚合酶(5 U/ μL)0.15 μL，加ddH2O至25 μL.反應(yīng)程序?yàn)?4℃5 min、94℃40 s、53℃50 s、72℃55 s，35個(gè)循環(huán)，然后72℃10 min.預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為856 bp.

1.4.4 TA克隆、測(cè)序及序列比對(duì)對(duì)PCR產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物與pUCm-T Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨后涂布在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜.挑取8個(gè)不同的白色單菌落于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，170 r/min搖床上培養(yǎng)過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒，并用M13通用引物擴(kuò)增，以檢測(cè)目的基因的存在.PCR檢測(cè)后，選陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.然后應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品的MT-co3序列進(jìn)行鑒定以及相似度分析.

1.4.5 PCR-RFLP根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用生物信息軟件提供的限制性內(nèi)切酶酶切信息，篩選經(jīng)濟(jì)而實(shí)用的酶切組合體系，最終選用NlaⅢ和HinfⅠ2種限制性內(nèi)切酶對(duì)10種海魚的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析.酶切體系為15 μl:內(nèi)切酶(10 000 U/mL)0.3 μL，CutSmart 1.5 μL，PCR產(chǎn)物6 μL，加ddH2O至15 μL，37℃酶切15 min.配制2.0%的瓊脂糖凝膠，對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本MT-co3序列的擴(kuò)增與測(cè)序

2.1.1 MT-co3序列的擴(kuò)增結(jié)果利用自行設(shè)計(jì)的通用引物對(duì)1～10號(hào)海魚樣本的MT-co3序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1.由圖1可知，盡管GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有高眼鰈、中間低鰭鯧MT-co3的序列，但其仍可被該通用引物所擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度約為856 bp，說(shuō)明自行設(shè)計(jì)的該引物通用性高.

圖1 10種海魚MT-co3基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 MT-co3 gene amplification from 10 species of marine fish

2.1.2 MT-co3測(cè)序結(jié)果分析每個(gè)魚種選送5個(gè)樣本，均采用雙向測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性檢索.檢索結(jié)果顯示，選用MT-co3基因作為分子標(biāo)記鑒定的魚種與形態(tài)學(xué)鑒定的魚種吻合，均不低于99%(表2)，且實(shí)驗(yàn)所得序列均為預(yù)期目的片段.該測(cè)序結(jié)果表明，至少在本研究中，MT-co3基因可用作鑒定不同海魚種的分子標(biāo)記.同時(shí)獲得了高眼鰈、中間低鰭鯧的MT-co3全序列，該序列準(zhǔn)備提交數(shù)據(jù)庫(kù).

表2 10種海魚的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果及在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification of 10 marine fish species in morphology and the NCBI database

2.2 PCR-RFLP結(jié)果及分析

2.2.1 MT-co3擴(kuò)增片段的酶切結(jié)果對(duì)10種魚全部樣本測(cè)序所得序列結(jié)果進(jìn)行限制性酶切分析顯示，各種魚所選5個(gè)樣本的NlaⅢ酶切后的片段長(zhǎng)度一致;而HinfⅠ酶切后，除小黃魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和花鱸3種魚中存在2種不一致的酶切結(jié)果外，其余7種魚所選樣本酶切后的片段長(zhǎng)度一致.酶切的位點(diǎn)數(shù)及酶切產(chǎn)物的片段大小見表3.

表3 2種內(nèi)切酶在PCR產(chǎn)物上的酶切位點(diǎn)數(shù)及消化后的片段長(zhǎng)度Tab.3 Restriction pattern of MT-co3 gene after PCR amplification and HinfⅠ/NlaⅢdigestion

此步的酶切實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2組，其中小黃魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和花鱸，從每種魚的5個(gè)平行樣本中選擇酶切分析有差異的2個(gè)樣本，其余每種魚5個(gè)平行樣本中隨機(jī)選取2個(gè)樣本，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后酶切.限制性酶切瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2(A和B)，酶切圖譜顯示與序列的酶切分析完全吻合.

圖2 10種海魚MT－co3基因擴(kuò)增序列的HinfⅠ和NlaⅢ酶切結(jié)果Fig.2 Digestion of MT-co3 gene PCR fragment with HinfⅠand NlaⅢrestriction enzymes

2.2.2 酶切結(jié)果分析在表2中，部分海魚MT-co3基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶消化后有一些小片段，比如經(jīng)HinfⅠ酶切后小黃魚產(chǎn)生的72 bp和玉筋魚產(chǎn)生的45 bp長(zhǎng)度的片段、經(jīng)NlaⅢ酶切后牙鲆產(chǎn)生的97 bp長(zhǎng)度的片段等，在圖2中并沒有出現(xiàn)或是條帶較暗，這可能是由于其分子太小，在電場(chǎng)中移動(dòng)速度比較快，或是目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物條帶本身不夠亮，酶切后的小分子顯色暗或達(dá)不到顯色的量.另外，圖2 NlaⅢ酶切的部分圖譜中，雖然PCR產(chǎn)物可以被酶切，但在856 bp處仍顯示有1條帶(如花鱸)，這歸因于沒有被內(nèi)切酶消化完全而殘留的PCR產(chǎn)物，可能是由于PCR產(chǎn)物較多，一定量的酶需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能將其消化完全，如果延長(zhǎng)酶切時(shí)間，可使該處條帶消失.

酶切結(jié)果之所以出現(xiàn)A、B圖式，是因?yàn)樾↑S魚(列1)、藍(lán)點(diǎn)馬鮫(列3)和花鱸(列7)MT-co3基因序列發(fā)生了單核苷酸點(diǎn)突變，分別為g.480T→C (小黃魚)、g.426T→C(藍(lán)點(diǎn)馬鮫)、g.498G→C，g. 501T→C，g.750C→A(花鱸)，導(dǎo)致了酶切位點(diǎn)的增加或缺失(圖3).從圖2和表3中可以看出，HinfⅠ酶切的譜帶在小黃魚、玉筋魚、鮐魚、中間低鰭鯧、花鱸和高眼鰈各不相同，許氏平鲉和白姑魚類似，牙鲆和藍(lán)點(diǎn)馬鮫可能會(huì)出現(xiàn)類似(圖2A);NlaⅢ酶切譜帶在牙鲆、藍(lán)點(diǎn)馬鮫、高眼鰈和許氏平鲉各不相同，玉筋魚、鮐魚、中間低鰭鯧和花鱸類似，小黃魚和白姑魚類似.所以單一的HinfⅠ或NlaⅢ酶切都不能將10種海魚進(jìn)行區(qū)分;盡管小黃魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和花鱸會(huì)出現(xiàn)2種酶切結(jié)果，但是依次使用HinfⅠ和NlaⅢ兩種酶酶切，仍可以將此10種海魚進(jìn)行有效的區(qū)分.

圖3 序列位點(diǎn)突變導(dǎo)致HinfⅠ酶切位點(diǎn)增加或缺失Fig.3 DNA site mutation causing HinfⅠEnzyme loci increasing or missing

3 討論

作為用于物種鑒別的基因應(yīng)具備2個(gè)特性，即相對(duì)穩(wěn)定的種內(nèi)保守性和種間變異性.MT-co1通常被用作DNA barcoding分析和海洋生物類群的群體遺傳研究［16］，但深入研究表明其在線粒體的15個(gè)主編碼基因中最為保守，這在群體遺傳研究中可能是不夠的［17］.有學(xué)者指出，只使用一個(gè)線粒體基因作為物種分類的唯一標(biāo)志物的理念，到目前并沒有得到良好的支持［18］.Sperling［19］認(rèn)為至少有1/4的物種是不容易用DNA Barcoding的方法來(lái)區(qū)分的.因此，探討其他線粒體基因用作DNA Barcoding的輔助分子標(biāo)記具有重要的現(xiàn)實(shí)意義.迄今為至，尚未見有以MT-co3基因作為分子標(biāo)記鑒定海魚魚種的相關(guān)研究報(bào)道，僅有程希婷［20］用MT-co3基因初步探討海南部分石珊瑚種間、種內(nèi)遺傳距離和分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系.本研究探討了MT-co3基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行魚類種屬的鑒別的實(shí)用性.將10種魚測(cè)序得到MT-co3基因序列及每種魚5個(gè)平行樣本測(cè)序得到的序列分別進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示MT -co3基因同樣具有種間變異較大、種內(nèi)較為保守的特征，理論上只要擴(kuò)增得到待檢樣品的MT-co3基因，結(jié)合適宜的限制性內(nèi)切酶酶切分析技術(shù)，便可對(duì)其進(jìn)行種源性鑒別.

就魚種的PCR-RFLP技術(shù)鑒定而言，要求在保證準(zhǔn)確性前提下簡(jiǎn)捷而實(shí)用，利用普通的瓊脂糖凝膠電泳即可清楚展示每種魚檢材的特異性譜帶.本研究選用HinfⅠ和NlaⅢ2種酶的組合，內(nèi)切酶種類少，但其瓊脂糖凝膠電泳酶切圖譜所含信息量大，足以揭示所研究的各魚種種源性.實(shí)驗(yàn)過(guò)程1 d即可完成，操作簡(jiǎn)單，成本較低，在普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室條件下即可開展此項(xiàng)工作.

需要提及，由于動(dòng)物體內(nèi)的線粒體DNA不發(fā)生遺傳重組，因此與細(xì)胞核DNA相比有較高的突變率，不同個(gè)體間可能偶見一定的變異發(fā)生，導(dǎo)致同一魚種內(nèi)出現(xiàn)異樣的酶切譜帶.在本研究的10種海魚中，小黃魚、藍(lán)點(diǎn)馬鮫和花鱸由于種內(nèi)MT-co3基因堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致檢測(cè)不出或產(chǎn)生額外的限制性酶切位點(diǎn)(集中發(fā)生在HinfⅠ酶切位點(diǎn)).因此，實(shí)踐應(yīng)用時(shí)可考慮選擇線粒體其它基因，比如MT -co1、cyt b、16S rRNA等分子標(biāo)記進(jìn)行分析鑒定;另一種策略是篩選其他適宜的限制性酶進(jìn)行酶切分析，這部分工作有待進(jìn)一步研究.

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Identification of Fish Species for Yantai Seafood Market based on Mitochondria DNA Polymorphism

YU Wei-xia1，LIU Xiao-ling1，WANG Min-qiang1，ZHAO Ming-ri1;WANG Jia-xuan2
(1.School of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，China;2.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan，250014，China)

The PCR-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)is used to identify 10 marine fish species(Larimichthys polyactis，Paralichthys olivaceus，Scomberomorus niphonius，Ammodytes personatus，Scomber japonicus，Peprilus medius，Lateolabrax japonicus，Cleisthenes herzensteini，Sebates schlegeli，Pennahia argentata，)with relatively important commercial value，which are randomly sampled from Yantai seafood market.The genomic DNAs of the 10 species of marine fish are extracted，and the mitochondria cytochrome c oxidase subunitⅢgene (MT-co3)of all samples are amplified with a pair of self-designed universal primers.The PCR products are then cloned and sequenced.RFLP analysis is carried out based on the sequencing result using two restriction enzymes，NlaⅢand HinfⅠ，to digest the PCR products.A specific-restriction map for each fish species is obtained through the PCR-RFLP method.The results show that the PCR-RFLP is a simple and accurate method that can effectively distinguish the 10 selected fish species.This method may provide scientific basis for fish food source testing.

polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP);species identification;cytochrome coxidase subunitⅢgene of mitochondrion DNA(MT-co3);marine fish

Q31

A

(責(zé)任編輯 周雪瑩)

1004-8820(2015)02-0097-06

10.13951/j.cnki.37-1213/n.2015.02.004

2014-11-01

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013CQ021).

于衛(wèi)霞(1984-)，女，山東臨沂人，碩士研究生.

王敏強(qiáng)(wangmqytu@163.com)，教授，博士，研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué).