何曉梅，陳存武，陳乃富，韓邦興，谷仿麗

1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽六安，237012

鹽膚木種子蛋白質(zhì)提取工藝的初步優(yōu)化

何曉梅1,2，陳存武1,2，陳乃富1,2，韓邦興1,2，谷仿麗1,2

1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽六安，237012

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定鹽膚木種子總蛋白質(zhì)含量，然后采用3種不同的方法提取其中的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明：鹽膚木種子總蛋白質(zhì)的含量約為9.501%。在本實(shí)驗(yàn)條件下，改良丙酮沉降法提取的蛋白質(zhì)含量較TCA-丙酮提取法和堿式提取法高。正交試驗(yàn)確定改良丙酮沉降法較優(yōu)工藝條件為:“料液比為1∶12 g·mL-1，提取時(shí)間為3 h，提取液與沉降蛋白所用丙酮量體積比1∶2，沉降時(shí)間為1.5 h。在較優(yōu)提取工藝條件下，鹽膚木蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到58.44%。

鹽膚木；蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；提取；正交試驗(yàn)

鹽膚木(Rhuschinensis)又名為“五倍子樹(shù)”，是漆樹(shù)科鹽膚木屬的落葉灌木或小喬木;角倍蚜(Schlechtendaliachinensis)是癭綿蚜科昆蟲(chóng)的1種。五倍子是由角倍蚜在其唯一夏寄主植物鹽膚木葉總軸的翅葉上形成的蟲(chóng)癭(角倍)，含有豐富的單寧，是醫(yī)藥、化工、食品、輕工和環(huán)保等行業(yè)的重要原料。因此，目前人們對(duì)鹽膚木的研究主要集中于鹽膚木的播種育苗及栽培技術(shù)[1-4]、角倍蚜蟲(chóng)癭對(duì)鹽膚木生理生化特性的影響及其關(guān)系上[5-7]等，以期提高五倍子的產(chǎn)量。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還對(duì)鹽膚木的分子生物學(xué)特性、逆境生長(zhǎng)特性、病蟲(chóng)害防治等進(jìn)行了相關(guān)研究。

近年來(lái)，鹽膚木及五倍子有效成分的提取及其生物活學(xué)研究有了很大進(jìn)展，提取的成分有五倍子多酚、五倍子酸、鹽膚木黃酮等；提取部位有五倍子、根、莖、葉和種子等；生物學(xué)效應(yīng)有抗氧化、抗腫瘤、抗病蟲(chóng)害、抑菌等[8-11]。陳存武等研究表明，鹽膚木種子含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)、脂肪、還原糖、礦質(zhì)元素等，其中蛋白質(zhì)含量為9.61～11.64 g/100 g[12]。陳宏偉等采用酸水解法，對(duì)我國(guó)亞熱帶常見(jiàn)的119種森林植物種子的蛋氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明鹽膚木的蛋氨酸含量達(dá)到36.89 mg/g ，為119種植物中含量最高者[13]。本研究采用改良丙酮沉降法、TCA-丙酮提取法和堿式提取法三種不同的方法提取鹽膚木種子中的蛋白質(zhì)，并對(duì)提取率較高的改良丙酮沉降法進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定鹽膚木蛋白質(zhì)提取的優(yōu)化參數(shù)，以期為鹽膚木種子蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽膚木種子采摘于霍山縣白馬尖，經(jīng)分揀、晾曬后粉碎，50℃烘干至恒重備用。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：凱氏定氮裝置(天長(zhǎng)市長(zhǎng)城玻璃儀器制造廠)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，DK-8D三孔三溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，HL-500A型高速多功能粉碎機(jī)(上海塞耐機(jī)械有限公司)，UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司)，智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海瑯王干實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

主要試劑：氫氧化鈉、鹽酸、丙酮、TCA(三氯乙酸)等，均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鹽膚木種子蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：凱氏定氮法

準(zhǔn)確稱取經(jīng)(40±2)℃干燥至恒重的樣品，平均分成3組，參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行蛋白質(zhì)總量的測(cè)定。計(jì)算公式如下：

式中，X為樣品中蛋白質(zhì)的百分含量，g；V1為樣品鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；N為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014為1 N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL相當(dāng)于氮克數(shù)；m為樣品的質(zhì)量(體積)，g(mL)；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

1.3.2 鹽膚木蛋白質(zhì)的不同提取方法

1.3.2.1 改良丙酮沉降法

按照谷瑞升等[15]的方法，準(zhǔn)確稱取1.217 1 g鹽膚木樣品粉末，加入12 mL蛋白質(zhì)提取液(表1)，在研缽中充分研磨混勻后轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，室溫超聲5 min后于4℃條件下提取1 h使蛋白質(zhì)充分溶解，12 000 r/min離心20 min，取清液，加入3倍體積-20℃預(yù)冷的丙酮并于-20℃下放置1 h使蛋白沉淀，12 000 r/min離心20 min，棄上清，丙酮完全揮發(fā)后按1∶5(w/v)加入蛋白溶解液(表1)溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，即為所提取的蛋白溶液(上述操作都在4℃進(jìn)行)。

1.3.2.2 TCA-丙酮提取法

按照董雙濤等[16]的方法略作修改，準(zhǔn)確稱取1.203 0 g鹽膚木樣品粉末，按1∶3(w/v)加入-20℃預(yù)冷的三氯乙酸和丙酮液(含10%(w/v)TCA和0.07%(v/v)β-巰基乙醇)研磨充分后轉(zhuǎn)入離心管中，-20℃沉降50 min，4℃12 000 r/min離心20 min，取沉淀置-20℃預(yù)冷的80%丙酮中(含0.07%β-巰基乙醇)，-20℃沉降1h，4℃12 000 r/min離心20 min，重復(fù)洗滌沉淀至無(wú)色，沉淀真空干燥，按1∶5(w/v)加入蛋白溶解液(表1)，4℃放置3 h，12 000 r/min離心20 min，獲得上清液，即為所提取的蛋白質(zhì)溶液。

表1 提取試劑配方

注：提取液與上樣緩沖溶液按表1配制好后，均加蒸餾水定容至100 mL。

1.3.2.3 堿式提取法

按照陶然等[17]的方法略作修改：準(zhǔn)確稱取1.256 0 g的樣品，按1∶10加入水，攪勻后加入3%的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至10，于50℃左右的水浴鍋中，不斷緩慢地?cái)嚢瑁沟鞍踪|(zhì)在堿性條件下溶解，離心保留提取液，調(diào)節(jié)pH至4.5，12 000 r/min離心分離，取沉淀，按1∶5加入蛋白溶解液，充分溶解蛋白后12 000 r/min離心分離，得蛋白質(zhì)溶液。

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化改良丙酮沉降法

比較3種不同蛋白質(zhì)提取方法的結(jié)果，確定進(jìn)一步優(yōu)化改良丙酮提取法。以物料與提取液配比、溶解時(shí)間、物料與沉降液配比、沉降時(shí)間為考察因素，以蛋白質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 蛋白質(zhì)提取率計(jì)算

采用Bradford法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量[18]。樣品中蛋白質(zhì)的含量(ug/g)=C×VT/(V1×m)，式中，C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)；VT為樣液總體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)；V1為測(cè)定時(shí)加樣量(mL)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 鹽膚木種子中蛋白質(zhì)總量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取3份樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)及空白試驗(yàn)，由表3可以看出鹽膚木中蛋白質(zhì)的總含量約為9.501%，即100 g鹽膚木中約含9.501 g蛋白質(zhì)。

表3 鹽膚木種子中蛋白質(zhì)總量

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支10 mL干凈的具塞試管，按表4進(jìn)行取樣后蓋上塞子，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合均勻，放置2 min后用1 cm光徑的比色皿在595 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，并記錄各試管測(cè)定的光密度OD595 nm，然后繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，曲線回歸方程為y=0.000 8x+0.008 3，R2=0.999 3。

2.3 不同提取方法獲得的蛋白質(zhì)提取率

采用3種不同的提取方法提取樣品中的蛋白質(zhì)，并通過(guò)紫外分光光度法在595 nm下測(cè)定樣品提取液的吸光度，計(jì)算得知改良丙酮沉降法獲得的蛋白質(zhì)提取率為43.56%，TCA-丙酮提取法提取率為34.29%，堿式提取法蛋白質(zhì)提取率為23.47%(表5)。

表4 考馬斯亮藍(lán)法繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5 不同提取方法獲得的蛋白質(zhì)提取率

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6分析結(jié)果可知，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化改良丙酮沉降法，影響蛋白質(zhì)提取效果因素的主次順序?yàn)锽>C>A>D，即溶解時(shí)間影響最大，依次是物料與沉降液丙酮配比、物料與提取液配比，預(yù)冷丙酮沉降時(shí)間影響較小，且最優(yōu)水平為A2B3C1D2，即最佳提取工藝條件為：料液比為1∶12，提取溶解時(shí)間為3h，提取液與沉降蛋白所用丙酮量體積比1∶2，沉降時(shí)間為1.5h。

表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

2.5 蛋白質(zhì)提取的驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)2.4獲得的最佳提取條件，分別稱取3份為1.003 2g、1.004 8g和1.001 7g的鹽膚木樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出蛋白質(zhì)提取率分別為57.33%、59.72%和58.27%，平均值為58.44%，與上述正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

(1)凱氏定氮法對(duì)本次樣品中蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定值為9.501g/100g鹽膚木。

(2)分別通過(guò)改良丙酮沉降法、TCA-丙酮提取法、堿式提取法3種不同的提取方法提取鹽膚木種子蛋白質(zhì)并計(jì)算提取率，結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)條件下，新式改良丙酮提取法提取的蛋白質(zhì)含量較其他2種方法高。

(3)運(yùn)用正交優(yōu)化改良丙酮沉降法的最優(yōu)提取條件為：料液比為1∶12，提取溶解時(shí)間為3h，提取液與沉降蛋白所用丙酮量體積比1∶2，沉降時(shí)間為1.5h。在此實(shí)驗(yàn)條件下，蛋白質(zhì)提取率為58.44%。

(4)根據(jù)1.3.2.2和1.3.2.3的實(shí)驗(yàn)條件，TCA-丙酮提取法和堿式提取法提取的蛋白質(zhì)含量較低，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

(5)鹽膚木種子蛋白質(zhì)的提取在國(guó)內(nèi)尚屬首次，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可為鹽膚木種子蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究提供參考。

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(責(zé)任編輯：汪材印)

Preliminary Optimization of Extraction Process ofRhusChnensisSeed Protein

HE Xiaomei1,2, CHEN Cunwu1,2,CHEN Naifu1,2,HAN Bangxing1,2,GU Fangli1,2

1.School of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,West Anhui University,Luan Anhui,2370122.Engineering Technology Research Center of Plant Cell Engineering, Anhui Province,Luan Anhui,237012

The content of protein fromRhusChnensisseed was assayed by Kjeldahl determination and three protein extraction methods were employed. The results showed that the content ofRhusChnensisseed protein was about 9.501%. Protein extracted by the improved acetone sedimentation method was higher than by the TCA-acetone extraction and basic extraction method.The optimum process conditions of improved acetone sedimentation method by orthogonal test were: the ratio of solid to liquid 1∶12 g·mL-1,extraction time 3 h,the ratio of protein extraction solution to acetone 1∶2,sedimentation time 1.5 h.Practicing this optimal condition,the extraction rate ofRhusChinensisprotein reached 58.44%.The experiment data was referred for further study of theRhusChinensisseed protein.

RhusChinensis;protein;Kjeldahl determination;extraction;orthogonal test

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.02.028

2014-11-25

國(guó)家公益性林業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目“鹽膚木新品種選育與示范”( 201204312)；國(guó)家自然科學(xué)基金“基于近紅外與電子鼻技術(shù)的藥用菊花道地藥材模式識(shí)別研究”(30901972)；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目“新木本油料植物鹽膚木油脂資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究”(KJ2011A273)“生姜病毒檢測(cè)試劑盒的研制與生姜脫毒快繁”(KJ2013A264)；安徽省自然科學(xué)一般項(xiàng)目“復(fù)合酶法制備純天然速溶綠茶的研究”(KJ2013B341)。

何曉梅(1974-)，女，安徽霍山人，碩士，講師，主要研究方向：天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。

TS229

A

1673-2006(2015)02-0109-04