李 靜，胡國全，桂敬強(qiáng)，賀紹君，劉德義，陳會(huì)良，靳二輝

（安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100）

夏枯草（Prunellavulgaris）屬于唇形科夏枯草屬植物，命名取其“夏至后即枯”之意，藥用部位為干燥果穗，全草也可入藥［1］，主要含有三萜及其苷類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分［2］。夏枯草在調(diào)節(jié)血壓和血糖，消炎殺菌，抗病毒感染，抑制腫瘤生長方面廣泛應(yīng)用［3］。Utsunomiya M 等［4］首次發(fā)現(xiàn)在體外模擬試驗(yàn)中夏枯草水提取液能有效抑制草酸鈣結(jié)晶的形成。夏枯草水提取液和甲醇提取物在體外對(duì)草酸鈣結(jié)晶形成均有抑制作用［5］，推測(cè)其原因可能夏枯草促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的成核作用，但因其促進(jìn)成核和微結(jié)晶作用，故而降低了草酸鹽的飽和度，從而顯著抑制草酸鈣晶體的聚集和生長［6-7］。草酸鈣結(jié)石屬中醫(yī)“石淋”、“砂淋”范疇［8］，病因是腎虛濕熱蘊(yùn)結(jié)于下焦、久之燒灼尿液中雜質(zhì)結(jié)成砂石［9］，夏枯草苦寒，能除濕瀉熱，疏肝解郁。同時(shí)，夏枯草利尿作用明顯，提示夏枯草可能成為防治結(jié)石的輔助藥物［10］。本試驗(yàn)采用含10ml／L乙二醇和10g／L氯化銨溶液的飲水誘導(dǎo)形成草酸鈣結(jié)石模型，測(cè)定小鼠血清、肝臟、腎臟、腦組織中鈣的含量，探究夏枯草對(duì)草酸結(jié)石小鼠的鈣代謝的影響，研究夏枯草對(duì)草酸結(jié)石小鼠腎小球和腎小管組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究其藥用價(jià)值和開發(fā)防治草酸結(jié)石的藥物提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)昆明小鼠30只，雄性，60日齡，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。試驗(yàn)鼠顆粒飼料中鈣含量1.43%，磷含量0.87%。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～24℃，濕度50%～65%，光照12h～13h。

1.1.2 藥品與試劑氯化銨（NH4Cl），批號(hào)：F20050621，分析純，乙二醇（C2H6O2），批 號(hào)：T20110608，分析純，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；夏枯草，安徽省福春堂中藥飲片有限公司產(chǎn)品（經(jīng)安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院時(shí)維靜教授鑒定為正品），產(chǎn)地：湖南，批號(hào)2011063；生化分析試劑盒：鈣試劑盒（批號(hào)142211014）、無機(jī)磷試劑盒（批號(hào)142411013），深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品；鈣測(cè)定試劑盒（批號(hào)20120413）、磷測(cè)定試劑盒（批號(hào)20120418）、用于測(cè)定組織蛋白的考馬斯亮藍(lán)試劑盒（批號(hào)20120415），南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器設(shè)備 自動(dòng)煎藥包裝機(jī)，青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司產(chǎn)品；Mindray BS-200全自動(dòng)血清生化分析儀；分光光度計(jì)；離心機(jī)；高壓蒸汽滅菌器；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)；漩渦混合儀；LEICA-RM-2128型切片機(jī)，LY-1型展片機(jī)；Olympus-CH30顯微攝影系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 草酸鈣成石液的配制 參照文獻(xiàn)［11］建立草酸鈣結(jié)石模型小鼠方法配制草酸鈣成石液：配制比例為：氯化銨1g，乙二醇1mL，用蒸餾水定容到100mL。

1.2.2 夏枯草水煎液的制備 將500g的夏枯草放入無紡布煎藥袋中，浸泡入5L水中2h，自動(dòng)煎藥包裝機(jī)煎煮至沸騰后文火30min，過濾；藥渣再次加入2.5L水，煎煮至沸騰后文火20min，將兩次濾液混合，濃縮至250mL，相當(dāng)于2g／mL，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱存放。

1.2.3 分組與采樣 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重相近原則分為對(duì)照組、結(jié)石組和夏枯草組。結(jié)石組和夏枯草組飲用草酸鈣成石液，對(duì)照組飲用蒸餾水。小鼠給藥則采用灌胃方式，夏枯草組灌胃夏枯草水提取液10mL／kg，對(duì)照組和結(jié)石組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，持續(xù)28d。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食不禁水過夜，稱重，雙側(cè)眼球摘除法采血，制備血清，血清中的鈣、磷含量用Mindray BS-200全自動(dòng)血清生化分析儀測(cè)定；處死剖檢，取肝臟，腎臟，腦組織。按公式計(jì)算腎體比，腎體比率（%）＝腎臟濕重（g）／宰前活重（g）×100，其中左側(cè)腎臟采用40g／L中性甲醛固定，石蠟包埋，6μm切片，HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)。肝臟，右側(cè)腎臟，腦組織用冰生理鹽水沖洗后制備100g／L的組織勻漿，用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測(cè)定鈣含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 夏枯草對(duì)草酸鈣結(jié)石小鼠體重和腎體比的影響結(jié)果見表1。

由表1數(shù)據(jù)可顯示，各組小鼠的宰前體重差異均不顯著，結(jié)石組的腎體比極顯著高于對(duì)照組，均數(shù)高0.52%，結(jié)石組的腎體比極顯著高于夏枯草組，均數(shù)高0.51%，而對(duì)照組和夏枯草組的腎體比差異不顯著。

表1 各組小鼠腎臟指數(shù)的比較Table 1 The comparison of kidney index in each group of mice

2.2 夏枯草對(duì)草酸結(jié)石小鼠血清鈣、磷及肝、腎、腦組織鈣含量的影響

由表2數(shù)據(jù)顯示，各組小鼠血清鈣含量差異均不顯著，結(jié)石組小鼠血清磷含量顯著高于對(duì)照組和夏枯草組（P＜0.05），對(duì)照組和夏枯草組的血清磷含量差異不顯著，結(jié)石組小鼠腎組織中鈣含量顯著高于對(duì)照組和夏枯草組（P＜0.05），對(duì)照組和夏枯草組的腎組織中鈣含量差異不顯著，各組肝組織、腦組織中的鈣含量各組差異均不顯著。

表2 各組小鼠血清鈣、磷及肝、腎、腦組織鈣含量的比較Table 2 The comparison of the calcium and phosphorus levels in sera and calcium in liver，kidney and brain in each group of mice

2.3 夏枯草對(duì)尿酸結(jié)石小鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響

草酸鈣結(jié)晶在常規(guī)HE病理切片下為無色透明晶體，由圖1可見正常組小鼠腎小體斷面接近圓形，毛細(xì)血管球位于腎小體中央且結(jié)構(gòu)完好，腎小囊壁層和臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腎小囊的結(jié)構(gòu)和體積大小正常，腎小管排列緊密，近端、遠(yuǎn)端腎小管組織結(jié)構(gòu)清晰且管腔大小正常，近曲小管管徑較粗，管腔較小，遠(yuǎn)曲小管管徑較細(xì)，管腔較大，腔面規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，對(duì)照組大鼠未見腎小管擴(kuò)張和草酸鈣晶體沉積，無病理變化；由圖2可見腎臟髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁上皮細(xì)胞排列整齊，管腔大小正常，細(xì)胞界限明顯。圖3中結(jié)石組小鼠腎小球體積和囊腔大小正常，皮質(zhì)部腎組織腫脹，近端腎小管的管壁腫脹變厚，管腔大小未見明顯變化，遠(yuǎn)端腎小管管壁輕微變薄且管腔擴(kuò)張，明顯變大；圖4中結(jié)石組部分髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁變薄且模糊，細(xì)胞數(shù)量減少，界線不清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞壞死、脫落、變性，細(xì)胞核大部分降解，胞漿減少，排列不整齊，腎小管腔顯著變粗大，異常擴(kuò)張，管壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，變性、壞死，腎小管腔內(nèi)有的大量彌漫散布的透明結(jié)晶體，部分結(jié)晶體形成較大的不規(guī)則四邊形或六邊形或連成片狀，部分腎小管的管腔內(nèi)可見嗜伊紅樣染色壞死物質(zhì)，部分腎間質(zhì)有明顯慢性炎性細(xì)胞浸潤。由圖5可見夏枯草組腎小球的輕度萎縮，腎小囊腔變大，腎小囊壁層和臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，近端腎小管的管壁腫脹輕度腫脹且管腔縮小，遠(yuǎn)端腎小管管壁變薄且管腔變大；圖6顯示夏枯草組腎髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合小管未見異常擴(kuò)張，但部分腎小管管壁變薄，上皮細(xì)胞界限較為清晰，部分腎小管管腔中有紅色絲狀物質(zhì)滲出，未見結(jié)晶體，髓袢細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。

圖1 對(duì)照組腎臟皮質(zhì)（HE，400×）Fig.1 Kidney cortex in control group（HE，400×）

圖2 對(duì)照組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig.2 Kidney medulla in control group（HE，400×）

圖3 結(jié)石組腎臟皮質(zhì)（HE，400×）Fig.3 Kidney cortex in oxalate calcium stone group（HE，400×）

圖4 結(jié)石組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig.4 Kidney medulla in oxalate calcium stone group（HE，400×）

圖5 夏枯草組腎臟皮質(zhì)（HE，400×）Fig.5 Kidney cortex in Prunella vulgaris intervention group（HE，400×）

圖6 夏枯草組腎臟髓質(zhì)（HE，400×）Fig.6 Kidney medulla in Prunella vulgaris intervention group（HE，400×）

3 討論

乙二醇是草酸的前體物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為草酸，從腎臟分泌排泄，氯化銨可酸化尿液，具有腎毒作用，可損害腎小管，二者協(xié)同，可形成泌尿系統(tǒng)的草酸鈣結(jié)晶［12］。采用乙二醇配合不同藥物或試劑作誘石劑誘發(fā)大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，可以篩選、評(píng)價(jià)防治結(jié)石藥物療效［13］。本試驗(yàn)中結(jié)石組的腎體比極顯著高于對(duì)照組和夏枯草組，可能草酸結(jié)石小鼠在氯化銨和乙二醇的刺激作用下，腎臟中草酸鈣結(jié)晶沉積及繼發(fā)的機(jī)械性、阻塞性炎癥使腎臟腫脹增重。夏枯草組與對(duì)照組腎體比接近，說明夏枯草可能在減少腎臟中草酸鈣結(jié)晶及緩解腎臟炎癥方面發(fā)揮一定的作用。

機(jī)體內(nèi)鈣的代謝異常是引起含鈣尿路結(jié)石的重要因素之一。泌尿系結(jié)石產(chǎn)生是由于體內(nèi)促進(jìn)結(jié)石和抑制結(jié)石的條件失衡所致，其成分以草酸鈣結(jié)晶居多［14-15］，其形成與體內(nèi)鈣代謝和沉積及草酸代謝有關(guān)。草酸鈣結(jié)石的形成與高鈣尿有關(guān)，腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管的上皮細(xì)胞受損導(dǎo)致鈣的重吸收障礙，也可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的黏附性增加［16］。肖勁逐 等［17］研 究 表 明，飲 用 10mL／L 乙 二 醇 ＋30g／L NH4Cl 3.0mL 每天分2次灌胃 Wistar健康雄性大鼠，連續(xù)4次給予一定劑量的夏枯草不同提取物干預(yù)，結(jié)果顯示各組鈣磷無差異，夏枯草水溶和夏枯草500mL／L甲醇組腎鈣明顯低于草酸鈣結(jié)石模型大鼠結(jié)石組。本研究的結(jié)果表明，各組血清鈣差異不顯著。結(jié)石組的腎組織鈣濃度明顯高于正常組和夏枯草組，差異有顯著性意義，可能由于腎組織中形成大量草酸結(jié)晶有關(guān)。在夏枯草干預(yù)下，能夠明顯降低造模后雄性小鼠血鈣和腎組織鈣的濃度，結(jié)石組血磷升高，可能是機(jī)體為了保證血鈣和血磷代謝的平衡，反饋地增強(qiáng)了腸道對(duì)磷吸收的結(jié)果。各組肝組織、腦組織的鈣含量差異均不顯著，說明尿道結(jié)石主要影響腎鈣的含量，而不影響其他臟器組織中鈣的含量影響。鈣磷代謝受動(dòng)物品系、試驗(yàn)條件等多種因素影響，夏枯草與鈣代謝的關(guān)系需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。

乙二醇和氯化銨是制備草酸鈣結(jié)石模型常用藥物，10g／L氯化銨和10mL／L乙二醇溶液給予小鼠自由飲用，可誘導(dǎo)形成草酸結(jié)石，本試驗(yàn)第28天，結(jié)石組的腎小管中可見大量的草酸結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張，與參考文獻(xiàn)［18］報(bào)道一致。腎組織內(nèi)的晶體沉積受到肝臟將乙二醇等草酸前體轉(zhuǎn)變?yōu)椴菟岬乃俣纫约澳蜮}和草酸的排泄等因素影響。從本試驗(yàn)可見夏枯草減少草酸結(jié)石小鼠腎組織中的結(jié)晶，并有效緩解腎小管和集合管的擴(kuò)張，減少腎小管上皮細(xì)胞的損傷，提示夏枯草可能存在抑制尿草酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，通過減少結(jié)晶保護(hù)腎臟，減少對(duì)腎小管的組織結(jié)構(gòu)的損傷。腎臟受損與草酸鈣晶體沉積相關(guān)，夏枯草可能通過吸附于草酸鈣晶體表面的能力增強(qiáng)，抑制草酸鈣結(jié)晶聚集和生長，以減緩腎小管細(xì)胞損傷。體外模擬環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在溫度、pH等多種因素差異，體外試驗(yàn)證明，0.25mL夏枯草水提液對(duì)10 mL人工尿液中的一水草酸鈣結(jié)晶的抑制指數(shù)隨NaCl濃度和pH升高逐漸降低［19］。體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)，抗草酸結(jié)石作用機(jī)理和途徑可能不同，雖然體外試驗(yàn)中夏枯草可顯著抑制草酸結(jié)晶的形成，提示夏枯草中可能存在抑制尿草酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，但其抗草酸結(jié)石的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

夏枯草水煎煮液能夠降低草酸結(jié)石小鼠腎組織中的鈣含量，但對(duì)血清、肝、腦組織勻漿中鈣含量均無顯著差異，夏枯草能夠減少腎小管內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的大小和數(shù)量，減緩草酸結(jié)石小鼠腎小管的擴(kuò)張程度，可保護(hù)腎臟的組織結(jié)構(gòu)，在防治草酸鈣結(jié)石中發(fā)揮一定的作用。

［1］劉 悅，宋少江，徐綏緒.夏枯草的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（1）：551.

［2］崔體圣，苗明三.夏枯草的化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用探討［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（3）：386-388.

［3］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：197-198.

［4］Utsunomiya M，Koide T，Yamaguchi S，et al.The effect of kampou medicine on the growth and aggregation of calcium oxalate crystalsinvitro［J］.Hinykika Kiyo，1991，37（10）：1097-1101.

［5］肖勁逐，李浩勇，梁培育，等.夏枯草提取物對(duì)尿草酸鈣結(jié)石形成的抑制作用［J］.中華試驗(yàn)外科雜志，2007，24（12）：1605.

［6］Gohel M D，Wong S P.Chinese herbal medieines and their efficacy in treating renal stones［J］.Urol Res，2006，34：365-372.

［7］Koide T，Yamaguehi S，Utsunomiya M，et al.The inhibitory effect of kampou extracts oninvitrocalcium oxalate crystallization andinvivostone formation in an animal model［J］.Int J Urol，1995，2（2）：81-86.

［8］劉海華，張亞強(qiáng).泌尿系結(jié)石中西醫(yī)結(jié)合研究概述與展望［J］.北京中醫(yī)藥，2013，32（7）：553-555.

［9］劉玲珠.中醫(yī)治療泌尿結(jié)石近況［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997（1）：152-153.

［10］肖勁逐.夏枯草提取物對(duì)尿草酸鈣結(jié)石形成及腎結(jié)石大鼠osteopontin表達(dá)的影響［D］.湖南長沙：中南大學(xué)衛(wèi)生部肝膽腸外科研究中心，2008.

［11］蔣一強(qiáng)，李 山，吳 闖，等.玉米須及芭蕉芯對(duì)小鼠腎草酸鈣結(jié)晶抑制作用的形態(tài)定量研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（3）：37-38.

［12］鐘 玲，蘇澤軒.乙二醇法復(fù)制腎結(jié)石模型給藥途徑和方法的比較［J］.中國病理生理雜志，2000，16（4）：381-382.

［13］黃幼霞.乙二醇和氯化銨灌胃建立大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型的探討［J］.海峽藥學(xué)，2014，26（1）：48-49.

［14］An Z，Lee S，Oppenheimer H，et al.Attachment of calcium oxalate monohydrate crystals on patterned surfaces of proteins and lipid bilayers［J］.J Am Chem Soc，2010，132（38）：13188-13190.

［15］姚家喜，錢 彪，王勤章，等.蜀葵根預(yù)防和治療大鼠腎草酸鈣結(jié)石的效果評(píng)價(jià)及機(jī)制初探［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（4）：329-332.

［16］Wahl C，Hess A.Kidney calculi-is nutrition a trigger or treatment［J］.Ther Umsch，2000，57（3）：138-145.

［17］肖勁逐，李浩勇，張國慶，等.夏枯草提取物對(duì)大鼠尿草酸鈣結(jié)石形成的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（11）：1486-1492.

［18］Divakar K，Pawar A T，Chandrasekhar S B，et al.Protective effect of the hydro-alcoholic extract ofRubiacordifoliaroots against ethylene glycol induced urolithiasis in rats［J］.Food Chem Toxicol，2010，48（4）：1013-1018.

［19］尹春萍，劉繼紅，張長弓.不同離子強(qiáng)度及pH值時(shí)澤瀉和夏枯草對(duì)草酸鈣結(jié)晶形成的抑制作用觀察［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，25（4）：321-322.