袁海蘭，歐仁建，胡 鯤，楊先樂＊

（1.上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫，上海201306；2.成都市龍泉驛區(qū)水務(wù)局，四川成都610100）

生物膜（biofilm）是一種附著于活組織或無活力的組織表面、由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外多聚基質(zhì)（extracellular maxtrix，ECM）包裹的有結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，由ECM及被其粘連的菌細(xì)胞構(gòu)成。它是相對于游離狀態(tài)菌細(xì)胞而言的另一種微生物的存在方式，可以保護(hù)菌細(xì)胞，有利于微生物抵抗外界不利因素［1-2］。水霉菌（Saprolegnia）是引起魚類發(fā)生水霉病的主要病原，其適應(yīng)溫度范圍廣，分布范圍亦很廣，一年四季都可以引起魚類發(fā)病［3］，水霉病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。且自孔雀石綠禁用以來還沒有一種有效的藥物用以治療水霉病。Ali S E等［4］于2013年首次報(bào)道水霉菌可以形成生物膜，水霉菌菌絲及相關(guān)繁殖體完全被包裹在胞外基質(zhì)中，胞外基質(zhì)能協(xié)助生物膜逃逸宿主的免疫并阻止藥物的滲透，使在施用藥物后，水霉菌仍可在生物膜中大量存活、生長和繁殖，從而對水產(chǎn)動(dòng)物構(gòu)成持續(xù)不斷的感染。

有研究表明，金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）對生物膜主要成分胞外基質(zhì)有破壞作用，且與抗菌藥物聯(lián)合使用殺菌效果更顯著，或?qū)⒊蔀橐环N潛在的治療生物膜相關(guān)病原感染的藥物［5-6］。本研究探索EDTA和兩種生產(chǎn)中常見防治水霉病藥物聯(lián)合對水霉菌生物膜的清除作用，以期為水霉病的治療尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 水霉菌株，寄生水霉（Saprolegnia parasitica）ATCC200013（1990年，分離自日本神奈川患水霉病的虹鱒）來自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、亞甲基藍(lán)、EDTA-2Na·2H2O為國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司產(chǎn)品；美婷為上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫提供，其主要成分為立達(dá)霉；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8（Cell Counting Kit-8）為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；熒光染色劑Calcofluor White M2RTinopal UNPA-GX為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EDTA對水霉菌游動(dòng)孢子最小抑菌濃度菌種接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平皿上，20℃將菌種活化。然后在平皿上鋪滿油菜籽，待菌絲長上菜籽，將菜籽移至滅菌蒸餾水中。20℃培養(yǎng)48h，待游動(dòng)孢子大量產(chǎn)生后，用3層滅菌紗布過濾棄去油菜籽，離心收集水霉菌孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子濃度調(diào)至2×106個(gè)／mL。

采用微量稀釋法，使EDTA終濃度為50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098、0.049、0.025mg／mL，測定EDTA 對水霉菌游動(dòng)孢子的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2 水霉菌生物膜體外構(gòu)建 在培養(yǎng)板中預(yù)先放入大小一致的無菌聚乙烯網(wǎng)片。將0.5mL孢子懸液和0.5mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基加入到24孔培養(yǎng)板中，20℃培養(yǎng)60h，體外構(gòu)建水霉菌生物膜［7］。

1.2.3 EDTA單獨(dú)及聯(lián)合抗菌藥使用對水霉菌生物膜的作用

1.2.3.1 藥物作用（1）抗菌藥的作用。生物膜培養(yǎng)60h后，用移液器吸出培養(yǎng)基，并用滅菌PBS清洗3次以去除游離菌。藥物試驗(yàn)組為亞甲基藍(lán)組20mg／L，40mg／L；美婷組10mg／L，20mg／L。分別添加1mL，20℃培養(yǎng)2h。以不添加藥物而加入無菌水作對照。試驗(yàn)重復(fù)2次。（2）EDTA單獨(dú)使用對生物膜的作用。生物膜培養(yǎng)60h后，用移液器吸出培養(yǎng)基，并用滅菌PBS清洗3次以去除游離菌。分別添加1mL濃度為1、4、16倍 MIC的EDTA。（3）聯(lián)合作用。分別添加20mg／L亞甲基藍(lán)、10mg／L美婷及 EDTA 終濃度為1、4、16MIC EDTA于成熟的水霉菌生物膜，20℃培養(yǎng)2h。

1.2.3.2 藥物作用后活菌量的檢測 按照試劑盒的說明使用CCK-8工作液。藥物作用后水霉菌生物膜洗滌后（亞甲基藍(lán)處理組需多次洗滌除去顏色），加入沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基和CCK-8工作液，放入28℃恒溫孵箱中培養(yǎng)3h，然后將反應(yīng)液平分在96孔板中，用酶標(biāo)儀測定每孔在450nm處的OD值。實(shí)際OD值為每個(gè)試驗(yàn)孔的吸光度值減去空白對照孔的OD值。

1.2.4 EDTA對生物膜結(jié)構(gòu)的影響 清洗后的水霉菌生物膜分成兩組：空白組置于滅菌PBS中，試驗(yàn)組放于16MIC的EDTA中作用后，滅菌PBS漂洗3遍，加200μL熒光染料Calcofluor White M2R（0.05%）避光染色1min，沖洗后放置在載玻片上，倒置熒光顯微鏡下觀察［8］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用EXCEL、SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物對水霉菌生物膜的作用

2.1.1 抗菌藥 從圖1可以看出，水霉菌生物膜形成之后，抗菌藥亞甲基藍(lán)、美婷在常用劑量下作用效果不佳，與對照組無顯著差異（P＞0.05），當(dāng)藥物濃度提高到2倍時(shí)亞甲基藍(lán)仍沒有表現(xiàn)出顯著作用，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 抗水霉菌藥物作用后水霉菌生物膜OD 450nm值Fig.1 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under different anti-Saprolegniadrugs

2.1.2 EDTA單獨(dú)及與抗菌藥聯(lián)合使用 用EDTA對水霉菌游動(dòng)孢子的最小抑菌濃度的1、4、16倍濃度（即1、4、16MIC）作用于成熟的水霉菌生物膜。從圖2和圖3可以看出，1MIC作用下對水霉菌生物膜無顯著影響（P＞0.05）。隨著EDTA的濃度升高，4MIC和16MIC對水霉菌生物膜有顯著的破壞作用，且當(dāng)EDTA與亞甲基藍(lán)或美婷聯(lián)合使用時(shí)，效果更佳，與兩者的單獨(dú)使用有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 EDTA作用后水霉菌生物膜胞外基質(zhì)變化

圖4A可以看出未加干預(yù)的成熟生物膜胞外基質(zhì)含量密集、呈云霧狀團(tuán)集，構(gòu)成了生物膜的基質(zhì)。而EDTA作用后胞外基質(zhì)明顯減少，呈小塊狀分散（圖4B）。

3 討論

水霉病是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病，一直以來主要用化學(xué)藥物治療。由于孔雀石綠在魚體內(nèi)殘留時(shí)間長，具有高毒素、高殘留等副作用，在全國禁用，由此水霉病的預(yù)防與治療又成為養(yǎng)殖界的難題［3］。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要使用亞甲基藍(lán)、美婷防控水霉病，但是水霉病并沒有得到全面控制。其原因可能是在水霉病暴發(fā)初期藥物作用明顯，當(dāng)水霉菌形成生物膜后，藥物作用效果降低。如本研究所示，水霉菌生物膜一旦形成，水霉菌對常用劑量下亞甲基藍(lán)和美婷不敏感，這與其對水霉菌菌絲的抑制及影響孢子釋放結(jié)果不一致；而使用2倍劑量時(shí)，美婷表現(xiàn)出一定的殺菌作用，亞甲基藍(lán)作用效果不佳。Ali S E等［4］使用2mg／L孔雀石綠及100mg／L溴硝醇處理水霉菌生物膜，并用大麻籽誘生藥物處理后的生物膜，結(jié)果大麻籽上重新長出游動(dòng)孢子囊并釋放游動(dòng)孢子，說明水霉菌被致密的生物膜結(jié)構(gòu)保護(hù)，即使在有效的藥物治療后仍能存活、繁殖。生物膜的形成對藥物的作用效果有極大的影響，且這種影響在生物膜形成的早期（黏附期）就出現(xiàn)，并且隨生物膜的成熟而增強(qiáng)，生物膜越成熟，就影響越大［1］。

圖2 EDTA單獨(dú)及與亞甲基藍(lán)聯(lián)合用藥后水霉菌生物膜的OD 450nm值Fig.2 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under EDTA alone and combination with methylene blue

圖3 EDTA單獨(dú)及與美婷聯(lián)合用藥后水霉菌生物膜的OD 450nm值Fig.3 OD 450nm values of Saprolegniabiofilms under EDTA alone and combinationwith Meiting

圖4 EDTA作用后水霉菌生物膜胞外多糖的變化Fig.4 The change of exopolysaccharide of Saprolegniabiofilms after EDTA treatment

抗菌藥物要對生物膜中菌體及其組分發(fā)揮作用的前提是必須滲透進(jìn)入生物膜［9-10］。研究表明，單獨(dú)抗生素給藥并無法滲透入生物膜內(nèi)部。尋找新的輔助藥物，以利于抗生素對生物膜發(fā)揮更大的作用是很有必要的。Devine D A 等［5］和 Kite P 等［6］研究顯示二價(jià)陽離子螯合劑EDTA能廣泛減少細(xì)菌及真菌生物膜微菌落。Emma J等［11］在研究EDTA對隱球菌生物膜形成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)EDTA可能通過影響鈣鎂離子運(yùn)輸抑制隱球菌，同時(shí)減少生物膜中隱球菌細(xì)胞分泌。本文首先測定了各種濃度的EDTA對水霉菌的抑菌作用，再聯(lián)合常用的抗菌藥處理水霉菌生物膜，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥作用效果明顯優(yōu)于美婷及亞甲基藍(lán)單獨(dú)使用，聯(lián)合用藥能較好地清除水霉菌生物膜。對EDTA處理后生物膜胞外基質(zhì)染色，觀察發(fā)現(xiàn)水霉菌生物膜胞外基質(zhì)被分散，菌絲暴露?？梢奅DTA本身對形成生物膜的水霉菌有殺菌作用，并且可以破壞生物膜結(jié)構(gòu)、促進(jìn)抗菌藥物的滲透，兩者合用可發(fā)揮顯著的抗生物膜活性。

EDTA作為一種金屬離子的鰲合劑，引入水生生物培養(yǎng)已有40多年了，如用于藻類和海洋無脊椎動(dòng)物的培養(yǎng)和育苗，起到保持某些元素溶解度及降低金屬離子毒性的作用，EDTA對水生生物的存活、生長及養(yǎng)殖環(huán)境的改善有一定作用［12］。而本研究結(jié)果表明，EDTA與抗菌藥聯(lián)合使用有望成為一種根除水霉菌生物膜感染的好方法，然而其使用劑量和應(yīng)用安全性及有待于更進(jìn)一步的研究。

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