董凱馨 張 帥 吳潔寧 余順慧

（重慶三峽學(xué)院，三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶萬州 404100）

鋅脅迫對狗牙根生理特性及鋅積累的影響
——以三峽庫區(qū)消落帶適生植物狗牙根為例

董凱馨 張 帥 吳潔寧 余順慧

（重慶三峽學(xué)院，三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶萬州 404100）

為了闡明鋅脅迫對三峽庫區(qū)消落帶適生植物狗牙根(Cynodon dactylon(Linn.)Pers)的毒害機(jī)制，為鋅污染水體、土壤植物修復(fù)提供理論依據(jù)．研究重金屬鋅對草本植物狗牙根新芽數(shù)、新根數(shù)、葉綠素、抗氧化酶系統(tǒng)的變化及重金屬鋅累積與分布的影響．結(jié)果表明：在0～80 mg/L Zn2+處理范圍內(nèi)，低濃度Zn2+對狗牙根新芽數(shù)、新根數(shù)及葉綠素含量表現(xiàn)出一定的促進(jìn)性，新芽和新根數(shù)增加，葉片葉綠素含量提高；高濃度Zn2+導(dǎo)致狗牙根新芽和新根數(shù)、葉片葉綠素含量下降．當(dāng)營養(yǎng)液中外源鋅濃度＜ 40 mg/L時(shí)，狗牙根葉片中SOD、POD酶活性都增加，但當(dāng)Zn2+濃度＞ 40 mg/L時(shí),狗牙根葉片中SOD和POD酶活性降低，而CAT活性一直下降．狗牙根積累的鋅主要分布于地下部分根，其次為莖．狗牙根能明顯吸收江水中的Zn2+，故狗牙根可以用于修復(fù)被鋅污染的水體、土壤，狗牙根具有潛在的應(yīng)用價(jià)值．

鋅脅迫；狗牙根;生理特性；積累

鋅是植物微量營養(yǎng)元素，同時(shí)也是環(huán)境污染元素．而三峽庫區(qū)消落帶重金屬的來源在于庫區(qū)廢棄物處置、大量施用農(nóng)藥和化肥以及冶煉、采礦、加工等，這導(dǎo)致了重金屬污染土壤、水體等環(huán)境，主要通過食物鏈的途徑對人類的健康造成威脅．故消除三峽庫區(qū)消落帶（土壤、水體中的）重金屬污染，是目前急需解決的問題之一．因此，研究鋅污染水體、土壤修復(fù)新技術(shù)具有重要意義．利用超積累植物對重金屬的富集特性而進(jìn)行植物修復(fù)，具有廉價(jià)、高效和安全等特點(diǎn)，已經(jīng)成為土壤、水體中重金屬污染研究領(lǐng)域的一項(xiàng)新興技術(shù)[1]．但多數(shù)超積累植物是入侵植物，存在生態(tài)安全隱患．狗牙根為多年生禾本科單子葉植物，其再生能力強(qiáng)，長期研究發(fā)現(xiàn)，其既耐干旱又耐深水淹沒，該物種對濕地（如三峽庫區(qū)消落帶）的生物修復(fù)與重建具有顯著的效果[2-4]．近年來，雖然國內(nèi)外許多學(xué)者致力于研究在重金屬脅迫下植物的耐性機(jī)理，如：本實(shí)驗(yàn)室用重金屬銅、鉛等脅迫狗牙根以研究其耐性機(jī)理，并取得了一定的成績[5-8]．但鋅脅迫狗牙根的耐性機(jī)理鮮有報(bào)道．本研究采用水培的方法，以狗牙根為研究材料[7]，通過研究鋅脅迫下狗牙根葉片中各項(xiàng)生理指標(biāo)，如：葉綠素含量、SOD、POD、CAT活性等的變化，弄清其耐性機(jī)理，以篩選耐重金屬的植物，為修復(fù)被重金屬污染的消落帶環(huán)境（土壤、水體）提供理論依據(jù)．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)植物 狗牙根(Cynodon dactylon）采于三峽庫區(qū)萬州牌樓消落帶．

1.1.2 試劑 Zn(NO3)2·6H2O（分析純）；用分析純配制霍格蘭德營養(yǎng)液．

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 AA-6300原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）、紫外分光光度計(jì)（T6新世紀(jì)）、MARS240微波消解系統(tǒng)（美國CEM公司）、TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)．

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

設(shè)5組實(shí)驗(yàn)，鋅濃度分別為0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，80 mg/L，以模擬Zn2+污染環(huán)境．每組3個(gè)平行．

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理 將采回的狗牙根幼苗依次經(jīng)過土培至長出新葉．移出，用自來水、去離子水沖洗整個(gè)植株，待去離子水中檢測不出Zn2+為止，最后放人廣口試劑瓶（65 mL）中，采用霍格蘭德營養(yǎng)液進(jìn)行純化培養(yǎng)．當(dāng)長出新根后，在不同鋅濃度的營養(yǎng)液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（將植株移入）．24 h連續(xù)通氣，將植株放在窗前，以進(jìn)行光合作用，每天觀察．補(bǔ)充液體量的蒸發(fā)量，過5 d更換一次營養(yǎng)液．所有營養(yǎng)液中的KH2PO4濃度減少為0.005 mmol/L（為了防止沉淀生成）．

1.3.2 檢測生理指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察植物的生長狀況，發(fā)現(xiàn)處理29 d后開始出現(xiàn)中毒癥狀，停止實(shí)驗(yàn)，收獲植株以檢測其生理指標(biāo)[5]．各項(xiàng)指標(biāo)及測定方法是：“南京建成生物工程研究所”所購買的試劑盒用于測定SOD、POD活性．用分光光度法[9]測定CAT活性，用丙酮—乙醇分光光度法[10]測定葉綠素含量．

1.3.3 鋅含量的測定 將被鋅脅迫29 d后的植株先用去離子水洗凈，莖和根分離，烘干（80oC鼓風(fēng)干燥箱），剪碎、研磨成均勻粉末[6]，0.200 0 g粉末被稱取，置于微波消解罐中，并加入混酸（濃HNO3︰濃H2SO4=4︰1）進(jìn)行消解，冷卻，過濾，濾液在25 mL容量瓶中定容，在塑料瓶中保存，測定粉末中Zn2+含量用原子吸收分光光度計(jì)（單位為mg/kg干重）．

1.4 分析數(shù)據(jù)

對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖采用Sigmapiot10.0軟件．

2 結(jié)果與討論

2.1 在外源鋅脅迫下狗牙根生長的影響

外源Zn2+脅迫時(shí)， 隨Zn2+濃度的逐漸升高對狗牙根的生長影響明顯（如圖1）：Zn2+濃度小于40 mg/L 時(shí)，狗牙根的新發(fā)芽數(shù)和新產(chǎn)生的根數(shù)均高于對照組，有逐漸增加的趨勢，在鋅濃度為40 mg/L時(shí)達(dá)到最大值；Zn2+濃度達(dá)到80 mg/L 時(shí)生長緩慢，29 d后出現(xiàn)明顯的毒害癥狀，第30 d 死亡． 說明低濃度的Zn2+促進(jìn)狗牙根生長，而較高濃度抑制其生長．

圖1 鋅脅迫對狗牙根植株新芽數(shù)、新根數(shù)的影響Fig.1Effects of Zn2+stress on the new sprout number，the new root number of C. dactylon

2.2 Zn2+脅迫對狗牙根抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.2.1 Zn2+脅迫對狗牙根SOD活性的影響

在植物體內(nèi)存在一個(gè)抗氧化酶系統(tǒng)，由SOD、POD、CAT三者組成，若要有效清除植物細(xì)胞內(nèi)的自由基和過氧化物[6,7]，則需要它們?nèi)叩南嗷f(xié)調(diào)作用．

SOD酶的功能是清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，在重金屬脅迫的逆境條件下，SOD能及時(shí)有效的清除狗牙根細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，最終保護(hù)了植物不被重金屬脅迫[6-7]．圖2可知，在低濃度重金屬Zn2+脅迫時(shí)，SOD酶活性升高，由于活性氧自由基的產(chǎn)生．Zn2+濃度為40 mg/L時(shí)，SOD活性達(dá)到最大；但隨處理濃度的進(jìn)一步升高，導(dǎo)致自由基在植物葉片細(xì)胞內(nèi)的大量積累，從而造成對植物細(xì)胞的過氧化傷害．因?yàn)橹亟饘賈n2+在狗牙根體內(nèi)積累量加大使狗牙根葉片細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)清除活性氧自由基能力減弱，故高濃度Zn2+處理使狗牙根SOD活性下降．這與周長芳、吳國榮等的研究結(jié)果一致[8]．

2.2.2 Zn2+脅迫對狗牙根POD活性的影響

在植物抗氧化系統(tǒng)中，POD酶和SOD酶一樣重要．其功能是將歧化產(chǎn)物（SOD酶的）分解成水和雙氧水．經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的逆境也可能增強(qiáng)POD的活性，由于逆境誘使植物產(chǎn)生更多的過氧化物．植物組織受到損害和破壞的程度越高，其POD活性也高[7]．由圖2可知，Zn2+處理濃度在0~20 mg/L時(shí)狗牙根葉片的POD活性穩(wěn)定呈略微上升趨勢；20~40 mg/L時(shí)上升幅度比較大，在重金屬Zn2+脅迫作用下，隨Zn2+濃度的升高，植株葉片內(nèi)POD活性也增加，此時(shí)Zn2+脅迫誘導(dǎo)了植物細(xì)胞內(nèi)POD活性[6]．Zn2+濃度大于40 mg/L時(shí)POD活性呈緩慢下降趨勢，這可能是因?yàn)殡S著Zn2+處理濃度的進(jìn)一步增大，狗牙根細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量的增加導(dǎo)致膜脂過氧化加劇，有害物質(zhì)大量產(chǎn)生，使POD活性下降，失去對細(xì)胞的保護(hù)作用．這與王愛云等的研究結(jié)果一致[11]

2.2.3 Zn2+脅迫對狗牙根CAT活性的影響

CAT是H2O2分解為O2和H2O的生物催化劑，能夠清除植物體內(nèi)的H2O2[7]．從圖2可知，隨著Zn2+濃度的增加，CAT活性呈下降趨勢，這可能是因?yàn)殡S著Zn2+濃度的增加和作用時(shí)間的延長，狗牙根體細(xì)胞內(nèi)SOD活性增加，導(dǎo)致H2O2生成量增多，過量的H2O2導(dǎo)致過氧化損傷，使狗牙根受到傷害，使CAT內(nèi)在分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變．因此，Zn2+脅迫抑制CAT酶的活性，表現(xiàn)出狗牙根葉片細(xì)胞中CAT酶的活性下降，這說明CAT活性更容易受到傷害[6]．

圖2 鋅脅迫對狗牙根植株CAT、SOD和POD酶活性的影響Fig.2Affects of Zn2+duress on the activities of CAT 、SOD and POD in leaves of C. dactylon

2.3 Zn2+脅迫對狗牙根葉綠素含量的影響

由圖3可見，狗牙根經(jīng)Zn2+處理后，在Zn2+濃度小于40 mg/L時(shí)，狗牙根葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量逐漸上升，這時(shí)葉綠素在Zn2+脅迫初期表現(xiàn)出一定的抗逆性．繼而隨著Zn2+濃度繼續(xù)增大，葉綠素含量迅速減少，整體趨勢呈下降．可能是由于Zn2+大量進(jìn)入狗牙根葉片細(xì)胞內(nèi)，加速葉綠素分解，同時(shí)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞[6]．

圖3 鋅脅迫對狗牙根植株葉綠素（a、b）含量的影響Fig.3Effects of Zn2+stress on chlorophyll（a、b）content in leaves of C. dactylon

2.4 Zn2+脅迫對狗牙根富集鋅的影響

從實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)霍格蘭德營養(yǎng)液中外源Zn2+濃度增加時(shí)，狗牙根莖和根積累Zn2+的量明顯增加，而且各處理間差異顯著（P < 0.05），見表1．重金屬Zn2+通過水體后，通過水體—植物系統(tǒng)進(jìn)入狗牙根體內(nèi)．從表1可以看出，狗牙根吸收的鋅主要集中在地下部分根．這說明根部積累的鋅只有部分轉(zhuǎn)移到地上部分的莖中．與對照組相比，在添加不同濃度Zn2+后，其根、莖中Zn2+質(zhì)量比差異較明顯，其遷移富集量表現(xiàn)為根>莖．因此，狗牙根主要通過根富集重金屬離子．

表1 Zn2+在狗牙根植物體內(nèi)的積累和分布情況1）Tab.1 Zn2+concentration and distribution in C. dactylon under Zn2+stress

1）相同列中含有不同字母作為上標(biāo)的表示差異顯著（P＜0.05）

3 結(jié) 論

1）狗牙根的生理特性在低濃度Zn2+脅迫下具有促進(jìn)作用，表現(xiàn)為：新根數(shù)、新芽數(shù)、葉綠素含量、SOD活性、POD活性增加，而高濃度Zn2+脅迫對上述指標(biāo)卻有抑制作用，但CAT卻相反，其活性表現(xiàn)為降勢．可能在鋅離子的脅迫下，為了減少重金屬的毒害作用，增強(qiáng)植株的抗逆性，只能清除過多的活性氧自由基，在狗牙根葉片細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)應(yīng)急系統(tǒng)，但是隨著Zn2+濃度升高和脅迫時(shí)間的延長，Zn2+的毒害作用開始顯現(xiàn)．降低抗氧化酶活性，可能是由于Zn2+破壞了．

2）目前狗牙根視為三峽庫區(qū)消落帶環(huán)境（土壤、水體）生物修復(fù)的首選物種之一．其具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，表現(xiàn)在雖然狗牙根不是Zn2+的超積累植物，但狗牙根具有富集Zn2+能力和長期耐干旱和水淹脅迫等優(yōu)勢，可以用于治理被Zn2+污染的環(huán)境（土壤、水體）．

[1]張?zhí)?，潘偉?根際環(huán)境與土壤污染的植物修復(fù)研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境，2003，12（1）：31-36.

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（責(zé)任編輯：張新玲）

Effect of Zn2+Stress on Physiological Characteristics of Cynodon dactylon and its Zn2+Uptake: with Special Reference to Cynodon Dactylon, a Plant Suitable in Three Gorges Reservoir

DONG kaixin ZHANG Shuai WU Jiening YU Shunhui
(Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservior, Wanzhou, Chongqing 404100, China)

In order to elucidate the toxic mechanisms of Cynodon dactylon under Zinc stress, this paper provides a theoretic foundation for phytoremediation of Zn2+-contaminated water, and screening experiment was conducted to investigate the effects of Zn2+on plant, the new sprout number, the new root number, the contents of chlorophyll, the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxide enzyme (POD), catalase (CAT) in the leaves and Zn2+accumulation and distribution in C. dactylon．The results indicated that the new root and bud number and the chlorophyll content of C.dactylon were increased under lower Zn2+concentrations. However, lower new root, bud number and chlorophyll content were observed for the higher Zn2+concentrations．The activities of SOD, POD were increased under40 mg / l Zn2+, but the activities of SOD, POD were decreased above 40mg / l Zn2+. CAT has been on the decline. Zn2+was distributed firstly in the C. Dactylon of roots and the secondly in the stems. This investigation also showed that C. dactylon could decrease the content of Zn2+in polluted water. The results suggest that C. dactylon be promising for the phytoremediation of Zn2+-contaminated soil and water．

Zn2+stress; Cynodon Dactylon; physiological characteristics; accumulation

Q945.7

A

1009-8135（2015）03-0004-04

2015-02-11

董凱馨（1990-），女，河北張家口人，重慶三峽學(xué)院碩士研究生，主要研究生態(tài)學(xué).

余順慧（1964-），女，重慶萬州人，重慶三峽學(xué)院教授，主要研究生態(tài)學(xué).

重慶高校市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目“三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治”（WEPKL2012MS-01）階段性成果