朱麗英，晏曉琴，凌敏潔，張紅漫，江凌

（1.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 210009）

磁性微球固定化啤酒廢酵母吸附重金屬鉛

朱麗英1，晏曉琴1，凌敏潔1，張紅漫1，江凌2

（1.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 210009）

以殼聚糖和海藻酸鈉為主要包裹材料制備了固定化啤酒廢酵母磁性微球，考察了海藻酸鈉濃度對微球成型和機械強度的影響，比較了固定化啤酒廢酵母磁性微球和游離廢酵母對重金屬Pb2+的吸附能力，采用重復(fù)批次吸附實驗研究了固定化啤酒廢酵母磁性微球的吸附穩(wěn)定性。結(jié)果表明，固定化啤酒廢酵母磁性微球?qū)b2+的吸附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離廢酵母。掃描電鏡照片表明固定化啤酒廢酵母磁性微球的內(nèi)部環(huán)境非常有利于酵母細(xì)胞的高密度附著，15批次的重復(fù)吸附實驗證明了磁性微球固定化的酵母細(xì)胞能長時間維持較高的活性。

啤酒廢酵母；磁性微球；固定化；鉛離子

重金屬污染是當(dāng)今最重要的環(huán)境問題之一，其中鉛（Pb）是一種性質(zhì)穩(wěn)定、分布廣、有蓄積性的重金屬類環(huán)境污染物。鉛及其化合物可以通過消化道、呼吸道進(jìn)入人體，在人體內(nèi)半衰期長，對多個器官都有一定危害，尤其對兒童腦部發(fā)育有較大危害。在鉛污染越嚴(yán)重的地方，兒童智力低下的發(fā)病率越高；兒童的血鉛水平每上升100μg·L－1，其智商（IQ）要下降6～8分。生物吸附法是處理大體積低濃度重金屬污染的一種理想方法，近年來逐漸成為研究熱點［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母不僅是具有實用潛力的生物吸附劑，也是研究重金屬生物吸附機理的良好材料［3-4］。酵母具有無毒性、易生長的特點，被稱為GRAS（generally regarded as safe）生物，用于污染治理易于為公眾所接受；并且，成熟的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)使得釀酒酵母成為最廉價的工業(yè)微生物；此外，酵母是生物學(xué)研究中的一種理想模式生物，研究酵母與重金屬的相互作用，易于在分子水平上深入探討其對重金屬的生物吸附機理，并可為其它生物體與重金屬的相互作用提供參考。

利用啤酒發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)生的廢酵母作為吸附材料，不但可以降低重金屬污染處理的成本，同時也能提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。然而，采用啤酒廢酵母吸附重金屬存在收集困難、難以重復(fù)利用等缺點；而以殼聚糖和海藻酸鈉等天然高分子為包裹材料，與磁性材料相結(jié)合制備固定化酵母磁性微球有望解決上述問題。殼聚糖和海藻酸鈉均是無毒、生物相容性好、可生物降解的生物質(zhì)材料，兩者通過靜電相互作用形成微囊［5］。磁性材料的應(yīng)用使得制備的聚電解質(zhì)微球能夠在外加磁場的作用下迅速分離，達(dá)到回收利用的目的，且操作簡便、價格低廉。

作者以磁性微球包埋的啤酒廢酵母作為重金屬Pb2+的吸附劑，分析了海藻酸鈉濃度對磁性微球的成型和機械強度的影響，比較了磁性微球固定化的啤酒廢酵母和游離廢酵母對重金屬Pb2+的吸附能力差異，并采用重復(fù)批次吸附實驗研究了固定化啤酒廢酵母磁性微球的吸附穩(wěn)定性。

1 實驗

1.1 材料、試劑、培養(yǎng)基及儀器

啤酒廢酵母（Saccharomyces cerevisiae），南京金陵啤酒廠。

海藻酸鈉、殼聚糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鉛，重慶昌宥科技有限公司；氯化鈣，西隴化工股份有限公司。所用試劑均為分析純。

Fe3O4納米顆粒，市售。

YPD液體培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%葡萄糖。

SPX-150-Z型搖床，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司； LXT-2型離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠；SBA-40C型SBA生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；FEI QUANTA200F型掃描電子顯微鏡，美國；QTS-25型質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司。

1.2 方法

1.2.1 海藻酸鈉濃度的確定

分別配制不同濃度（5 mg·L－1、10 mg·L－1、15 mg·L－1、20 mg·L－1、25 mg·L－1、30 mg·L－1）的含0.2 g Fe3O4顆粒的海藻酸鈉溶液20 mL，轉(zhuǎn)移至20 mL醫(yī)用注射器中，滴入到50 mL含1%（mg/100 mL，下同）CaCl2的10 mg·L－1殼聚糖溶液中，觀察成球情況，并做機械強度實驗，采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行擠壓，使其變形，記錄所使用的力。從成球情況、制備的難易程度和機械強度等方面來確定海藻酸鈉的最佳濃度。

1.2.2 磁性微球及固定化酵母磁性微球的制備［5］

磁性微球的制備：稱取Fe3O4顆粒1.0 g，加入到100 mL 20 mg·L－1的海藻酸鈉溶液中混勻，用針管抽取一定量混合液，滴加至不斷攪拌的含1%CaCl2的10 mg·L－1的殼聚糖溶液中，攪拌30 min。

菌懸液的制備：挑取一環(huán)酵母菌接入100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，25℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)物3 000 r·min－1離心5 min，收集沉淀，用無菌生理鹽水配成濃度為0.1 g·mL－1的菌懸液。

酵母菌的包埋和活化：取1mL菌懸液與20mL 20 mg·L－1海藻酸鈉溶液混合，再加入0.5%Fe3O4納米顆粒攪拌均勻后，轉(zhuǎn)入20mL注射器中，滴加至不斷攪拌的10 mg·L－1的殼聚糖溶液中，攪拌30 min。得到直徑為3～5 mm的固定化小球。4℃冰箱過夜后，用無菌生理鹽水洗滌2～3次，接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)。25℃活化24 h后，換新鮮YPD液體培養(yǎng)基，繼續(xù)活化24 h，置4℃冰箱備用。

1.2.3 游離酵母與固定化酵母磁性微球?qū)b2+吸附能力的比較

取2mL 0.2mol·L－1的硝酸鉛溶液分別加入到4份100 mL的YPD液體培養(yǎng)基（標(biāo)記為1#、2#、3#、4#）中，其中1#、2#培養(yǎng)基中加入50顆固定化酵母磁性微球，3#、4#培養(yǎng)基中接入5 mL 0.1 g·mL－1的菌懸液，25℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。分別在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h取樣5 mL，用EDTA法測Pb2+濃度。

1.2.4 固定化酵母磁性微球的重復(fù)批次吸附實驗

將固定化酵母磁性微球100顆接入100 mL YPD培養(yǎng)基（含0.2 mol·L－1的硝酸鉛溶液2 mL）中進(jìn)行批式發(fā)酵。發(fā)酵條件為25℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)。在前一個批次吸附反應(yīng)結(jié)束后，采用磁鐵吸附沉淀的方式收集固定化酵母磁性微球。將微球在100 mL的KNO3溶液中低速攪拌24 h，收集微球，添加新鮮YPD培養(yǎng)基，進(jìn)行下一個批次的吸附實驗，實驗共進(jìn)行15個批次，每個批次為10 h。用EDTA法測Pb2+濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉濃度對磁性微球制備成型的影響（表1）

表1 海藻酸鈉濃度對磁性微球制備成型的影響Tab.1 Effect of sodium alginate concentration on the form ing ofmagneticm icrospheres

從表1可以看出，海藻酸鈉濃度直接影響固定化酵母磁性微球的成型情況。海藻酸鈉濃度太低，微球的包埋性能差，被固定化酵母細(xì)胞容易泄漏導(dǎo)致固定化功能失效；隨著海藻酸鈉濃度的增加，微球顆粒制備成型好，載體對細(xì)胞的包埋程度增強，但與此同時液體的黏度不斷增大，微球制備難度加大，而且可能影響物質(zhì)在微球顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散，進(jìn)而影響酵母菌的生長和發(fā)酵性能。因此，初步確定海藻酸鈉最佳濃度為20 mg·L－1。

2.2 海藻酸鈉濃度對磁性微球機械強度的影響（圖1）

由圖1可知，隨著海藻酸鈉濃度的增大，磁性微球的機械強度明顯增大，濃度大于20 mg·L－1后，微球的機械強度增幅減緩。由于海藻酸鹽由1，4-β-D-甘露糖醛酸（M段）和1，4-α-L-古羅糖醛酸（G段）兩種結(jié)構(gòu)單元通過α-1，4糖苷鍵連接成不同比例的GM、MM和GG組合，從而形成線性共聚物［6］。隨著海藻酸鈉濃度的增大，單位體積海藻酸鈉分子數(shù)增加，與殼聚糖更易作用，長鏈之間也更容易堆砌纏結(jié)，因此海藻酸鈉濃度增大可以使磁性微球硬度增大。綜合微球成型和機械強度，確定海藻酸鈉最佳濃度為20 mg·L－1。

圖1 海藻酸鈉濃度對磁性微球機械強度的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on mechanical strength ofmagneticm icrospheres

2.3 游離酵母與固定化酵母磁性微球?qū)b2+的吸附曲線（圖2）

圖2 游離酵母與固定化酵母磁性微球?qū)b2+的吸附曲線Fig.2 Adsorption curves of Pb2+of free and immobilized yeastmagnetic m icrospheres

由圖2可知，固定化酵母磁性微球?qū)b2+的吸附能力超出游離酵母15倍之多（30 000μmol·g－1vs.2 000μmol·g－1）。磁性微球固定化酵母對Pb2+的吸附量在約2 h后達(dá)到最佳，約6 h后吸附趨于飽和。這是由于，一方面，磁性微球內(nèi)部呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，存在大量孔洞（圖3），為酵母細(xì)胞的高密度提供了良好的微環(huán)境及傳質(zhì)傳熱條件；另一方面，由于磁性微球材料殼聚糖的分子中含有羥基和氨基活性基團(tuán)，能與重金屬離子配位形成絡(luò)合物，與水溶液中的Pb2+產(chǎn)生絡(luò)合作用，而海藻酸鈉分子中含有大量游離的羧基，能夠與金屬離子發(fā)生反應(yīng)，因此對Pb2+均具有一定的吸附作用［7］。同時，微球可使包埋的酵母細(xì)胞免受外界環(huán)境（如機械剪切力）的損傷，這在很大程度上延長了酵母的使用壽命。

2.4 磁性微球固定化酵母細(xì)胞的重復(fù)批次吸附實驗（圖4）

圖3 磁性微球（a）和固定化酵母細(xì)胞（b）的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM Images ofmagneticm icrospheres（a） and immobilized yeast cells（b）

圖4 磁性微球固定化酵母細(xì)胞重復(fù)批次吸附實驗Fig.4 Repeated batch adsorption experiment of magneticm icrospheres immobilized yeast cells

由圖4可知，隨著重復(fù)批次的增加，磁性微球固定化酵母細(xì)胞對Pb2+的吸附量保持穩(wěn)中略降的趨勢，第15批相比第1批的吸附量下降了30%左右。酵母吸附Pb2+的過程主要分為兩個階段：首先，Pb2+吸附到細(xì)胞表面，其特點是快速、可逆、不依賴于能量代謝；第二階段，Pb2+穿透細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，以較慢的速度繼續(xù)累積進(jìn)入細(xì)胞，速度慢、不可逆、與能量代謝有關(guān)，最終被細(xì)胞正常的生長代謝所轉(zhuǎn)化［8］。上述實驗證實了磁性微球固定化的酵母細(xì)胞能長時間維持較高的活性。

3 結(jié)論

海藻酸鈉濃度為20 mg·L－1時制備的殼聚糖/海藻酸鈉磁性微球成球性好，形狀、大小均勻，并且具有較高的機械強度。磁性微球固定化后的啤酒廢酵母細(xì)胞對Pb2+的吸附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于游離酵母，并且重復(fù)使用15批次后，對Pb2+的吸附性能仍能保持70%以上，顯示了良好的應(yīng)用前景。

［1］WANG J，CHEN C.Biosorbents for heavymetals removal and their future［J］.Biotechnology Advances，2009，27（2）：195-226.

［2］LO Y C，CHENG C L，HAN Y L，et al.Recovery of high-valuemetals from geothermal sites by biosorption and bioaccumulation［J］.Bioresource Technolgy，2014，160：182-190.

［3］UBEDA JF，MALDONADO M，BRIONES A I，et al.Bio-prospecting of distillery yeasts as bio-control and bio-remediation agents［J］.Current Microbiology，2014，68（5）：594-602.

［4］SOARESE V，SOARESH M V M.Bioremediation of industrial efflu-ents containing heavymetals using brewing cells ofSaccharomyces cerevisiae as a green technology：A review［J］.Environmental Science andPollution Research，2012，19（4）：1066-1083.

［5］ZHU L Y，LIN D Q，YAO S J.Biodegradation of polyelectrolyte complex films composed of chitosan and sodium cellulose sulfate as the controllable release carrier［J］.Carbohydrate Polymers，2010，82（2）： 323-328.

［6］RIJO P，MATIASD，F(xiàn)ERNANDESA S，et al.Antimicrobial plant extracts encapsulated into polymeric beads for potential application on the skin［J］.Polymers，2014，6（2）：479-490.

［7］MOTWANIS K，CHOPRA S，TALEGAONKAR S，et al.Chitosan-sodium alginate nanoparticles as submicroscopic reservoirs for ocular delivery：Formulation，optimisation andin vitrocharacterisation［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2008，68（3）： 513-525.

［8］KURODA K，SHIBASAKIS，UEDA M，et al.Cell surface-engineered yeast displaying a histidine oligopeptide（hexa-His）has enhanced adsorption of and tolerance to heavymetal ions［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57（5-6）：697-701.

Adsorption of Heavy M etal Lead w ith W aste Beer Yeast Immobilized in M agnetic M icrosphere

ZHU Li-ying1，YAN Xiao-qin1，LING M in-jie1，ZHANG Hong-man1，JIANG Ling2
（1.College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China； 2.College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

Themagnetic microspheres used to immobilize waste beer yeastwere prepared with chitosan and sodium alginate as themain packagematerials.Effects of sodium alginate concentration on the forming and mechanical strength ofmagnetic microspheres were investigated.The adsorption capactity of heavy metal lead ion with immobilized and free yeast cellswas further compared.In addition，repeated batch adsorption experimentwas used to test the adsorption stability ofmagnetic microspheres with immobilized waste beer yeast.The results showed that，the adsorption capacity of lead ion of immobilized yeast cells inmagneticmicrosphereswasmuch higher than thatof free yeast cells.SEM Images indicated that the internal immobilized environmentwas very conducive to the attachment of high density of yeast cells.The 15 batches of repeated adsorption experiment demonstrated that the immobilized yeast cells could maintain higher activity for a long time.

waste beer yeast；magnetic microsphere；immobilization； lead ion

X 703.1

A

1672-5425（2015）07-0018-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.005

江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK20131046，BK20130917），江蘇省高校自然科學(xué)基金面上項目（14KJB530003），教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助項目（20123221120011）

2015-03-19

朱麗英（1982－），女，湖南郴州人，博士，講師，研究方向：生物化工；通訊作者：江凌，副教授，E-mail：jiangling@njtech.edu.cn。