鄭偉，楊維旭，李冬梅，譚洪波，劉春景，孔令新（吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林吉林 132101）

燃料乙醇生產(chǎn)中低聚糖及有機(jī)酸的HPLC分析及應(yīng)用效果

鄭偉，楊維旭，李冬梅，譚洪波，劉春景，孔令新（吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林吉林 132101）

在燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程中，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)低聚糖及有機(jī)酸進(jìn)行監(jiān)測(cè)；探討了HPLC法的跟蹤效果，并對(duì)有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：對(duì)發(fā)酵液開(kāi)展HPLC檢測(cè)，在生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及決策上效果理想，可滿(mǎn)足過(guò)程監(jiān)控的需求。

燃料乙醇；低聚糖；有機(jī)酸；發(fā)酵液；糖化酶；酵母；染菌

在燃料乙醇的生產(chǎn)中，成熟的發(fā)酵技術(shù)就是嚴(yán)格的過(guò)程控制，體現(xiàn)的是從低聚糖到發(fā)酵產(chǎn)物并形成有機(jī)酸的過(guò)程，而過(guò)程控制的實(shí)現(xiàn)，需要對(duì)過(guò)程參數(shù)進(jìn)行合理選取和有效監(jiān)測(cè)。其中低聚糖及有機(jī)酸的監(jiān)測(cè)是掌握生產(chǎn)中通過(guò)酵母的發(fā)酵將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的必備手段；組分能夠被及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)，可充分表達(dá)發(fā)酵工序運(yùn)行狀態(tài)，對(duì)避免染菌、使乙醇收率最大化起到指導(dǎo)性作用。

在燃料乙醇的生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)仍沿續(xù)著常規(guī)的化學(xué)方法監(jiān)測(cè)工藝過(guò)程，對(duì)發(fā)酵工藝指標(biāo)還局限在還原糖、揮發(fā)酸、殘總糖的層面上，而國(guó)外（如美國(guó)Corn Plus及Renew Energy燃料乙醇公司）已采用高效液相色譜（HPLC）法分析，是對(duì)發(fā)酵過(guò)程更為精細(xì)化和最為直接的分析方法；通過(guò)測(cè)定低聚糖［（低聚糖4-10糖）、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖］、有機(jī)酸、醇（乳酸和丙三醇、醋酸）、發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物（乙醇）等含量，可非常直觀地表達(dá)工藝中各罐的發(fā)酵狀況，最終確定工藝參數(shù)。這些精細(xì)化指標(biāo)對(duì)工藝的運(yùn)行條件更為具體、實(shí)用，這不僅僅是檢測(cè)儀器或分析方法的提升，更是對(duì)生產(chǎn)工藝管理的促進(jìn)［1］。

吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司質(zhì)檢中心自2004年起，參照Cerestar、Corn Plus及Renew Energy公司的檢測(cè)方法，對(duì)發(fā)酵醪液開(kāi)展了HPLC的全程監(jiān)測(cè)，在合理控制糖化酶用量、發(fā)酵溫度，避免酵母抑制以及染菌對(duì)酵母產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)性抑制上，效果較為理想，為生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及決策提供了更為科學(xué)的數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑及儀器

麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸鋰、丙三醇、醋酸鈉、無(wú)水硫酸鈉、乙醇，均為色譜純，Sigma Aldrich化學(xué)公司［2］。

Flexar LC10系統(tǒng)，Perkin Elmer公司，軟件Chromera Manager Ver 4.1.0.6386，phenomenex REZEXTMROA Organic Acid色譜柱（300 mm×7.8 mm，8μm），AJO-4490預(yù)處理柱（50 mm×7.8 mm，8μm）。

1.2 方法

1.2.1 低聚糖及有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取8種標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相（0.0025 mol·L－1H2SO4）溶解并定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液；混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度見(jiàn)表1。

1.2.2 樣品預(yù)處理

為避免酶解及發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，需檢測(cè)發(fā)酵醪液的初始pH值。用65%H2SO4將醪液pH值調(diào)至1.0～1.5，4 000 r·min－1離心5min。取上清液50mL，定容到100 mL，0.22μm水系濾頭過(guò)濾至色譜樣品瓶中，自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析。

表1 低聚糖及有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度/［g·（100 m L）－1］Tab.1 Concentration of oligosaccharides and organic acid m ixed standard solution

1.2.3 色譜條件

流動(dòng)相為0.0025mol·L－1H2SO4，流速0.6mL· min－1，柱箱溫度65℃，RID溫度50℃，進(jìn)樣量20μL，運(yùn)行時(shí)間25 min。

1.2.4 低聚糖及有機(jī)酸定性、定量方法

先以保留時(shí)間、樣品加標(biāo)來(lái)進(jìn)行定性；再以峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 低聚糖及有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程和線(xiàn)性范圍（表2）

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回歸方程和線(xiàn)性范圍Tab.2 Regression equation and linear range ofm ixed standard solution

2.2 燃料乙醇生產(chǎn)中發(fā)酵液的液相色譜（圖1）

圖1 發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Spectrum of fermentation liquid

由圖1、表2可知，發(fā)酵液中各組分分離度較好，含量線(xiàn)性范圍涵蓋合理，相關(guān)性較高，滿(mǎn)足方法的適用性要求。

在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析時(shí)，組分中會(huì)分離出其它的發(fā)酵產(chǎn)物；其中，阿拉伯糖、丁二酸、甲醇系發(fā)酵過(guò)程中正常產(chǎn)物，對(duì)發(fā)酵影響不大；果糖系液化過(guò)程中淀粉鏈還原端的一些葡萄糖單元在高pH值和高溫的聯(lián)合作用下異構(gòu)生成。發(fā)酵液中重點(diǎn)關(guān)注的組分：（低聚糖4-10糖，合峰）、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸、丙三醇、醋酸、乙醇。

2.3 HPLC對(duì)發(fā)酵過(guò)程的跟蹤應(yīng)用首先，在發(fā)酵早期監(jiān)控分布，可讓工藝人員了解淀粉酶將淀粉轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的程度，并確定投酵母的具體時(shí)間。其次，后面出峰的組分（乳酸、丙三醇、醋酸和乙醇）代表在發(fā)酵期間所產(chǎn)生的有機(jī)酸和乙醇。監(jiān)控這些組分，可便于工藝人員確認(rèn)發(fā)酵終點(diǎn)；并指導(dǎo)工藝人員添加嚴(yán)格控制的限量抗生素，來(lái)抑制細(xì)菌的污染，及防止其它可能導(dǎo)致抑制乙醇生產(chǎn)的情況發(fā)生［3］。

2.3.1 理想的發(fā)酵狀態(tài)

利用HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程，理想的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3。

在進(jìn)行HPLC分析的同時(shí)，將HPLC的分析結(jié)果同發(fā)酵溫度、酵母的活細(xì)胞數(shù)及出芽率相結(jié)合，對(duì)燃料乙醇生產(chǎn)具有更好的指導(dǎo)效果。

表3 理想的發(fā)酵結(jié)果Tab.3 Data of ideal ferm entation

2.3.2 有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果

利用HPLC對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行跟蹤分析，有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表4～7。

1）糖化酶用量

表4 有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果1Tab.4 Problem ferm entation data 1

表5 有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果2Tab.5 Problem fermentation data 2

2）發(fā)酵溫度

表6 有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果3Tab.6 Problem fermentation data 3

分析表6結(jié)果可知，發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較高的發(fā)酵溫度、較慢的酵母利用葡萄糖的速率、較高的丙三醇數(shù)值、低的乙醇產(chǎn)率、較高的有機(jī)酸、較低的出芽率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是發(fā)酵溫度過(guò)高造成酵母生長(zhǎng)受抑制。因此，應(yīng)采用較低的發(fā)酵溫度32～33℃。

3）染菌

表7 有問(wèn)題的發(fā)酵結(jié)果4Tab.7 Problem fermentation data 4

分析表7結(jié)果可知，發(fā)酵過(guò)程存在的問(wèn)題為較慢的葡萄糖利用效率、較高的有機(jī)酸、較低的乙醇產(chǎn)率、較低的出芽率和活細(xì)胞數(shù)。原因可能是染菌造成對(duì)酵母的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，在酵母培養(yǎng)和發(fā)酵罐中應(yīng)添加抑菌劑。

3 結(jié)語(yǔ)

1）通過(guò)HPLC法對(duì)燃料乙醇生產(chǎn)中的發(fā)酵液進(jìn)行低聚糖及有機(jī)酸的檢測(cè)分析，是過(guò)程控制的最為有效的手段，其多組分分離的方法直觀、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確；為生產(chǎn)裝置平穩(wěn)運(yùn)行提供了準(zhǔn)確數(shù)據(jù)信息，實(shí)現(xiàn)了過(guò)程質(zhì)量管理及控制的動(dòng)態(tài)分析。

2）依據(jù)HPLC檢測(cè)發(fā)酵不同時(shí)間段數(shù)據(jù)的累積，可有效掌握液化、糖化工序、酶作用底物的效果，了解淀粉在整個(gè)乙醇生產(chǎn)工藝的水解程度和水解產(chǎn)物特性，能更直觀地表達(dá)發(fā)酵過(guò)程中各罐的發(fā)酵狀況；為掌握酶作用底物效果，酵母的充分利用等生產(chǎn)運(yùn)行狀態(tài)，確定合理工藝參數(shù)，避免罐內(nèi)物料染菌，提高轉(zhuǎn)化率，可以起到很好作用效果，是生產(chǎn)、工藝管理者及操作者理想的控制資料和數(shù)據(jù)，具有重要的指導(dǎo)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

［1］MCGINLEYM，MOTT J.Ethanol Production Monitoring Using Ion Exclusion Hplc.

［2］楊毅，李崎，陳蘊(yùn)，等.反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測(cè)定啤酒中有機(jī)酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（8）：6-12.

［3］劉文信.HPLC在酒精發(fā)酵醪液檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.化學(xué)工程師，2013，（2）：28-30.

HPLC Analysis and App lication Effect of O ligosaccharides and Organic Acid in the Production of Fuel Ethanol

ZHENG W ei，YANG W ei-xu，LIDong-mei，TAN Hong-bo，LIU Chun-jing，KONG Ling-xin
（Jilin Fuel Alcohol Company Limited，Jilin 132101，China）

The content of oligosaccharide and organic acid in the production process of fuel ethanolwas determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The tracking effect of HPLC was discussed，and the problem of fermentation data were analyzed.The results showed that，HPLC analysis of fermentation liquid was ideal in the production process optimization and decision making，and met the requirements of processmonitoring.

fuel ethanol；oligosaccharides；organic acid；fermentation liquid；saccharifying enzyme；yeast；bacterial contamination

TQ 923 O 657.72

A

1672-5425（2015）07-0067-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.018

2015-03-05

鄭偉（1965－），女，吉林省吉林市人，碩士，高級(jí)工程師，主要從事燃料乙醇的質(zhì)量管理，E-mail：zhengw.jfa@cnpc.com.cn；通訊作者：楊維旭，高級(jí)工程師，E-mail：yangwx.jfa@cnpc.com.cn。