雷霄飛+楊學領(lǐng)

摘 要：用PCR方法擴增黃瓜花葉病毒部分復制酶基因（CMV△Rep），連接到PUCm-T載體上構(gòu)建成克隆載體PUCm-T-CMV△Rep。用BamHⅠ和SalⅠ分別對克隆載體PUCm-T-CMV△Rep和植物表達載體pBIN438進行雙酶切，獲得目的片段和線性質(zhì)粒。在T4 DNA連接酶的作用下進行定向連接，構(gòu)建成植物表達載體pBIN438- CMV△Rep。采用CaCl2凍融法將重組子導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，表明重組質(zhì)粒pBIN438- CMV△Rep已成功導入根癌農(nóng)桿菌中。

關(guān)鍵詞：復制酶基因；載體構(gòu)建； 農(nóng)桿菌； 黃瓜花葉病毒

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）08-13-02

PBIN438-CMV△Rep Expression Vector and its Transformation in Agrobacterium Tumefaciens

Lei Xiaofei et al.

（Department of science and technology， Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China）

Abstract：Cucumber mosaic virus partial replicase gene were amplified by PCR （CMV Rep），connected to the PUCm-T vector to construct the cloning vector of PUCm-T-CMV Rep. With BamH I and Sal I of PUCm-T-CMV cloning vector Rep and the plant expression vector pBIN438 were digested， obtained fragment and linear plasmid. Directional connection in T4 DNA ligase， a plant expression vector was constructed by pBIN438-CMV Rep. Using CaCl2 freeze-thaw method the recombinant plasmid into Agrobacterium LBA4404. By PCR and double enzyme digestion showed that the recombinant plasmid， pBIN438- CMV Rep has been successfully introduced into Agrobacterium tumefaciens.

Key words：Replicase gene； Vector construction； Agrobacterium tumefaciens；Cucumber mosaic virus

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是一種寄主范圍非常廣泛的病毒，可以侵染多種經(jīng)濟類作物，導致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。利用基因工程技術(shù)將病毒本身的一部分基因轉(zhuǎn)化至植物基因組中獲得具有抗病性的植株是當前病毒病防治的主要途徑[1-2]。

本實驗利用PCR技術(shù)獲黃瓜花葉病毒CMV△Rep基因片段，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有該序列的植物表達載體pBIN438-CMV△Rep，為利用基因沉默技術(shù)進行植物廣譜抗病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5a，根癌農(nóng)桿菌LBA4404和質(zhì)粒pBIN438；PUCm-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SmaⅠ等均購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 含CMV△Rep基因質(zhì)粒DNA的制備 挑取含有載體pCAMBIA1302-CMV△Rep的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，根據(jù)堿裂解法提取質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 帶特定酶切位點的CMV△Rep基因的引物設計與合成 依據(jù)CMV△Rep基因的序列設計擴增引物，引物的合成、測序分析工作均由大連寶生物公司完成。Rep-F5'-GATAACTAAGTGGTGG-3'，Rep-R（SalI）5'-CGGTCGACCCAGACTTCTTGTATTTC-3'。

1.2.3 PUCm-T-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 回收CMV△Rep基因片段，與PUCm-T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，涂布于含有Amp的平板上，隨即挑取單菌落，37℃振蕩培養(yǎng)，PCR檢測并測序[3]。

1.2.4 pBIN438-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 利用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切PUCm-T-CMV△Rep和pBIN438，PUCm-T-CMV△Rep酶切基因用瓊脂糖凝膠回收，T 4DNA連接酶過夜，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，在抗Amp的培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆菌落，并用PCR擴增鑒定，獲得植物表達載體pBIN438-CMV△Rep[4]。

1.2.5 重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及CMV△Rep基因檢測 采用CaCl2凍融法將植物表達載體pBIN438-CMV△Rep轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，在篩選培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，獲得陽性菌落，經(jīng)過PCR擴增和酶切鑒定后保存[5]。

2 結(jié)果和分析

2.1 CMV△Rep基因片段的PCR擴增 以pCAMBIA1302-CMV△Rep為模板，用引物Rep-F和Rep-R 擴增CMV△Rep基因后進行電泳， 獲得一條約500bp的目的基因，與預期結(jié)果相符。使用凝膠回收試劑盒回收CMV△Rep基因片段。

2.2 pBIN438-CMV△Rep載體的構(gòu)建及鑒定 將構(gòu)建好的質(zhì)粒PUCm-T-GFP測序，通過DNAstar和Oligo6軟件對比，與GenBank中CMV△Rep基因序列一致。用BamHⅠ和SalⅠ對重組質(zhì)粒PUCm-T-CMV△Rep進行雙酶切，獲得目的基因CMV△Rep，以pBIN438為基本結(jié)構(gòu)，通過雙酶切切開，并和CMV△Rep基因鏈接，獲得植物表達載體pBIN438-CMV△Rep，結(jié)構(gòu)圖見圖1。以pBIN438-CMV△Rep基因為模板，用引物Rep-F和Rep-R擴增CMV△Rep基因后進行電泳，結(jié)果顯示擴增出一條500bp左右的基因片段。

圖1 pBIN438-CMV△Rep表達載體結(jié)構(gòu)

2.3 根癌農(nóng)桿菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep轉(zhuǎn)化及鑒定 重組質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep導入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，平板培養(yǎng)，對陽性克隆菌落進行PCR檢測，重組的農(nóng)桿菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep可以擴增出約500bp的基因片段。通過提取質(zhì)粒，再用BamHⅠ和 SalⅠ對重組質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep進行雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切后的CMV△Rep基因片段，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)?？梢员磺谐?個片段，大片段大于2 000bp，小片段為CMV△Rep約為500bp，結(jié)果見圖2。說明載體pBIN438-CMV△Rep已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。

圖2 質(zhì)粒pBIN438-CMV△Rep的雙酶切鑒定

3 討論

植物病毒是造成作物減產(chǎn)的重要原因，傳統(tǒng)的育種抗病、農(nóng)藥、脫毒等方法對于病毒的治理不僅耗時而且污染環(huán)境，近年來發(fā)現(xiàn)的基因沉默被證明能很好的抗相關(guān)病毒的侵染。植物抗病毒基因工程廣泛采用基于病毒復制酶基因的抗病策略，復制酶基因介導的抗病性具有抗病性強的特點，是解決植物病毒病害的有效方法，已經(jīng)在生產(chǎn)實際中取得較好的效果。本文是在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有這種病毒復制酶的植物表達載體，擬用于今后進一步對神農(nóng)香菊的遺傳轉(zhuǎn)化，希望通過沉默基因的轉(zhuǎn)化來培育出具有抗黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植株，從根本上解決危害神農(nóng)香菊的黃瓜花葉病毒病害問題。

參考文獻

[1]Ding S W， Anderson B J， Haase H R， et al. New overlapping gene encoded by the cucumbermosaic virus genome[J]. Virology，1994，198：593-601.

[2]牛顏冰，青玲，周雪平.RNA沉默機制及其抗病毒應用[J].中國生物工程雜志，2004，24（2）：76-79.

[3]張響玲，張延龍， 牛立新，等. 岷江百合中黃瓜花葉病毒誘導的LrPR10的克隆及表達分析[J].園藝學報，2014，41（6）：1218-1226.

[4]尤佳，張寧，文義凱，等.Gry ⅢA基因植物表達載體構(gòu)建及馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化[J].草業(yè)學報，2014，23（1）：248-256.

[5]尚愛芹，田傳衛(wèi)，趙梁軍，等.Z根癌農(nóng)桿菌介導北海道黃楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學報，2008，35（3）：409-414.

（責編：張長青）