逯連靜+陳明杰+邢增濤+陳國榮

摘 要：采用不覆膜（control）與覆蓋厚度為12μm、打6孔聚氯乙烯膜（PVC12-6）的方式分別對(duì)草菇進(jìn)行保鮮貯藏，觀察比較其蛋白酶活性，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究草菇在貯藏期絲氨酸蛋白酶（SER）基因表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明：（1）control的草菇蛋白酶活性在儲(chǔ)藏前期快速增加，在48h酶活性為3.81U/g·min，72h有所下降，但96h達(dá)到高峰，為5.80U/g·min；而PVC12-6的草菇蛋白酶活性在貯藏前期緩慢增加，在96h達(dá)到高峰，為2.76U/g·min，隨后快速下降；在貯藏期間，control的草菇蛋白酶活性一直比PVC12-6高。（2）control的絲氨酸蛋白酶基因表達(dá)量在48h達(dá)到最大，隨后表達(dá)量下降較慢，且48h之后的表達(dá)量遠(yuǎn)高于24h的表達(dá)量；而PVC12-6的絲氨酸蛋白酶基因表達(dá)量在48h達(dá)到最高點(diǎn)后迅速下降，48h后的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于24h的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：草菇；實(shí)時(shí)熒光PCR；絲氨酸蛋白酶；貯藏期

中圖分類號(hào) S63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）08-31-04

Expression of the Serine Protease Gene in Volvariella volvacea during Different Storage Time

Lu Lianjing1 et al.

（1Information Research Institute of Science and Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Abstract：The activity of protease of Volvariella volvacea which were packaged by perforated packaging film were investigated.The expression of the serine protease gene of the samples in different storage time were investigated by real-time quantitative PCR.The results showed that the fruit bodies with non-packaging retainedhighest activity of protease which was 5.80U/g·min at 96h.Another sample reached thehighest activity of protease at 96h.The relative expression of SER gene of all samples exhibited a rapid increase at 48h，then they were continuous decrease.But the rate of decreased expression in control was lower than another sample.This result was coincidence relation with the activity of protease.

Key words：Volvariella volvacea；Real-time quantitative PCR；Perforated packaging film；Storage time

草菇（Volvariella volvacea）不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，還有重要的醫(yī)療保健作用。草菇屬于典型的熱帶菇，呼吸作用旺盛，采后細(xì)胞仍處于活躍狀態(tài)，其在低溫貯藏時(shí)會(huì)出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，不能像其他食用菌一樣在低溫冰箱中保存，因此其保鮮技術(shù)難度較大。鮮菇采后的生化作用都是在各種酶的作用下進(jìn)行的，研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)草菇貯藏保鮮影響最大的因素之一是蛋白酶[1]，它可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生降解，使大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì)。菇體的腐爛與蛋白質(zhì)的降解有關(guān)，蛋白酶的活性越高，蛋白質(zhì)降解越也嚴(yán)重，菇體腐爛就越快。而蛋白酶活性與該酶的表達(dá)量有一定的關(guān)聯(lián)，如Burton[2]研究發(fā)現(xiàn)，雙孢蘑菇采收后，其衰老過程中氮源的代謝分解主要靠絲氨酸蛋白酶，該酶的表達(dá)量升高比酶活的升高提前24h，且兩者具有正相關(guān)即表達(dá)量越高，酶活也越高。目前國內(nèi)研究草菇保鮮方法大都采用物理和化學(xué)的方法，但未從分子水平深層次進(jìn)行研究。為此，本試驗(yàn)通過覆蓋膜并打孔的方式包裝草菇，研究在一定的貯藏期內(nèi)蛋白酶活性的變化與絲氨酸蛋白酶（SER）基因表達(dá)變化規(guī)律，從分子水平來探討蛋白酶表達(dá)量與酶活性的相關(guān)性，以達(dá)到調(diào)節(jié)酶活性的目的，為今后進(jìn)一步研究草菇保鮮方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 草菇（V.volvacea）V23子實(shí)體材料來自上海寧郁菌菇有限公司，同批采收，采前不噴水，選擇成熟度、顏色一致，大小均勻，且無病害無損傷的草菇子實(shí)體。聚氯乙烯膜PVC12（厚12μm）購于杭州恩希愛化工有限公司。聚丙烯托盤（165mm×45mm）購于上海中央化學(xué)有限公司。

1.2 處理方法 取當(dāng)天采收子實(shí)體，每120g左右（10～12個(gè)）裝于聚丙烯托盤中，用聚氯乙烯膜包裝，并在膜上（面積165mm×115mm）均勻打6個(gè)孔（直徑1.3mm），以不覆膜為對(duì)照組（control），放置在15℃無光照的生化培養(yǎng)箱內(nèi)，每處理每隔24h取3盒，每盒為1個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶活性測(cè)定 參照Chavira等的方法[3]。

1.3.2 草菇子實(shí)體總RNA的提取與純化 草菇子實(shí)體總RNA的提取參照汪虹等[4]的方法進(jìn)行，用DNase處理去除基因組DNA，然后用DEPC處理的雙蒸水溶解，-70℃保存?zhèn)溆谩?

1.3.3 草菇子實(shí)體總RNA的RT-PCR 草菇子實(shí)體cDNA的合成參照汪虹等[4]的方法。

1.3.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)草菇gpd基因cDNA全長(zhǎng)序列（Genbank登錄號(hào)：DQ14038）和絲氨酸蛋白酶基因片段序列設(shè)計(jì)定量引物。

1.3.5 目的片段擴(kuò)增 采用常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)，應(yīng)用表1的引物，進(jìn)行g(shù)pd基因與絲氨酸蛋白酶基因片段的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。

表1 定量PCR引物

[引物＼&堿基數(shù)＼&序列＼&Ser-F＼&22＼&5TGCCTTGACCTTTACCTACACC-3＼&Ser-R＼&20＼&5-GCAACACCAAACTGGCTTCC-3＼&god-F＼&21＼&5-GGCTTGATGACCACCGTACAT-3＼&gpd-R＼&24＼&5-GCACCAGTGGAAGATGGAATAATG-3＼&]

1.3.6 制備標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒 構(gòu)建含gpd基因與SER基因片段的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，參照汪虹等[4]的方法。

1.3.7 SER基因定量測(cè)定 采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，可以忽略目的基因Ser和參照gpd擴(kuò)增效率的不一致。將SER和gpd重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍梯度稀釋后，分別以系列稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，得到2個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以2種處理不同儲(chǔ)藏時(shí)間的草菇子實(shí)體cDNA 2μL為模板分別進(jìn)行SER基因和gpd基因的定量擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)重復(fù)。另每批設(shè)2μL ddH2O作為模板的空白對(duì)照。反應(yīng)條件為95℃、5s，51℃、10s，72℃、15s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)草菇子實(shí)體蛋白酶活性的影響 如圖1所示，control子實(shí)體的酶活性在24h（control子實(shí)體在貯藏期腐爛較快，96h后失去實(shí)驗(yàn)意義，因此未采集數(shù)據(jù)）之后陡然上升，除了在24h與PVC12-6的酶活性沒有明顯差異外，其他貯藏期都存在顯著性差異，且在48h達(dá)到了貯藏期的一個(gè)小高峰，為3.81U/g·min，隨后72h有所回落，96h又陡然上升到5.80U/g·min。PVC12-6的子實(shí)體蛋白酶酶活性在24h之后的貯藏期都明顯低于control，且酶活性上升較慢，只有在96h才達(dá)到高峰，僅為2.76U/g·min，隨后都逐漸下降。

圖1 不同處理對(duì)草菇子實(shí)體蛋白酶活性的影響

2.2 RNA的提取和目的片段的擴(kuò)增 提取的草菇子實(shí)體RNA經(jīng)DNase處理去除基因組DNA后，瓊脂糖電泳結(jié)果表明RNA分子保持完整，以此為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增目的基因SER和內(nèi)標(biāo)基因gpd，瓊脂糖電泳在200bp附近獲得條帶，與預(yù)期大小相符（圖2），經(jīng)測(cè)序目的條帶與原始序列同源性為100%。

[M][1][2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100bp]

圖2 SER基因片段

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 圖3、圖4為梯度稀釋SER質(zhì)粒的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，由Rotor-Gene3000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件自動(dòng)生成，同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。從標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3、4）可以看出，起始模板濃度與CT值之間存在良好線性關(guān)系，SER基因標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為conc=10^（-0.315*CT+10.461），內(nèi)標(biāo)基因gpd標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為conc=10^（-0.299*CT+8.930），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程可以得到未知樣品中目的基因和內(nèi)標(biāo)基因起始模板濃度。

圖3 絲氨酸蛋白酶質(zhì)粒擴(kuò)增曲線

圖4 絲氨酸蛋白酶質(zhì)粒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 不同處理貯藏期SER基因表達(dá) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程對(duì)CT值換算得起始濃度，對(duì)目的基因濃度與內(nèi)標(biāo)基因濃度比值進(jìn)行比較，得到2個(gè)處理在貯藏期間（0h的SER基因表達(dá)量極少，未檢測(cè)出，因此從24h開始檢測(cè)）草菇子實(shí)體中Ser基因表達(dá)量變化（表2、3）。結(jié)果顯示，2個(gè)處理在貯藏期為48h時(shí)SER基因表達(dá)量都達(dá)到一個(gè)峰值，之后都持續(xù)下降（圖5、6）；control子實(shí)體的SER基因表達(dá)量在48h之后緩慢下降，且表達(dá)量都高于24h的表達(dá)量；PVC12-6子實(shí)體的SER基因表達(dá)量在48h達(dá)到1.85之后急速下降，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于24h的表達(dá)量。

表2 處理中control在不同儲(chǔ)藏期草菇子實(shí)體SER基因表達(dá)量

[15℃下儲(chǔ)藏時(shí)間（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相對(duì)濃度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相對(duì)濃度＼&相對(duì)

含量＼&24＼&24.61＼&523＼&15.12＼&4266＼&1.00＼&48＼&23.54＼&1118＼&16.17＼&2192＼&4.25＼&72＼&23.07＼&1556＼&15.05＼&4445＼&2.92＼&96＼&22.78＼&1909＼&14.34＼&6990＼&2.25＼&]

表3 處理中PVC12-6在不同儲(chǔ)藏期子實(shí)體SER基因表達(dá)量

[15℃下儲(chǔ)藏

時(shí)間（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相對(duì)濃度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相對(duì)濃度＼&相對(duì)

含量＼&24＼&18.32＼&2986＼&15.86＼&6199＼&1.00＼&48＼&17.09＼&7802＼&15.36＼&8764＼&1.85＼&72＼&19.83＼&921＼&16.82＼&3197＼&0.60＼&96＼&18.42＼&2757＼&14.90＼&12007＼&0.48＼&120＼&18.86＼&1959＼&15.07＼&10686＼&0.38＼&144＼&19.80＼&942＼&15.93＼&5921＼&0.33＼&]

圖5 control在不同儲(chǔ)藏期SER基因表達(dá)量變化

圖6 PVC12-6在不同儲(chǔ)藏期SER基因表達(dá)量變化

3 結(jié)論與討論

草菇采后后熟作用較強(qiáng)，會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)并產(chǎn)生孢子，而采后由于不能從培養(yǎng)料中吸取養(yǎng)分，從而只能靠子實(shí)體自身的代謝來維持。草菇采后碳代謝的碳源為子實(shí)體的甘露醇、海藻糖和一些糖原[5]，而氮代謝的氮源則主要為可溶性蛋白[6]。據(jù)報(bào)道，可溶性蛋白的降解伴隨著蛋白酶的活性增高，且蛋白酶活性越高菇體腐爛越快，保鮮效果越差。蛋白酶中主要起作用的是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[6]，而Burton等[7]研究表明，菇體在采收后，氮源營養(yǎng)代謝起主要作用的為絲氨酸蛋白酶，該酶導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì)，從而加速腐爛衰老。

絲氨酸蛋白酶蛋白首先轉(zhuǎn)錄為酶前體，然后必須被水解，其過程為蛋白酶前體通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，然后其前肽被水解掉即可變?yōu)橛谢钚缘拿竅7]。衰老子實(shí)體中的絲氨酸蛋白酶位于胞外還是胞內(nèi)至今還不清楚，但是雙孢菇菌絲中的絲氨酸蛋白酶則位于胞外[8]。因此，絲氨酸蛋白酶的活性升高需要2個(gè)條件：一是該酶的基因表達(dá)量增大，該酶大量被轉(zhuǎn)錄翻譯；二是該酶必須經(jīng)過水解，然后通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移后變?yōu)橛谢钚缘拿?。若該酶被大量轉(zhuǎn)錄翻譯但被水解掉的酶前體較少，則該酶活性較低；反之若該酶的基因大量轉(zhuǎn)錄翻譯且其前體被水解掉，則該酶活性較高。

楊淑云等[1]認(rèn)為草菇在儲(chǔ)藏過程中蛋白酶活性增強(qiáng)是導(dǎo)致草菇軟腐的原因之一。巫光宏等[9]研究了草菇蛋白酶活性在不同溫度下的變化，表明蛋白酶活性越高，草菇越容易腐爛。草菇采后在室溫下只能放置1～2d，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，control中的草菇子實(shí)體的蛋白酶活性在貯藏期較高，在48h達(dá)到了一個(gè)小高峰，此時(shí)子實(shí)體已經(jīng)出現(xiàn)腐爛衰敗現(xiàn)象，96h后則完全失去食用價(jià)值，其酶活性達(dá)到了貯藏期內(nèi)最高。但PVC12-6的草菇子實(shí)體的蛋白酶活性在貯藏期內(nèi)較低，最高峰出現(xiàn)在96h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于control酶活性，試驗(yàn)中PVC12-6的草菇在144h內(nèi)未出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。此研究與巫光宏等的研究結(jié)果相一致。

蛋白酶的活性與該酶的基因表達(dá)量息息相關(guān)。Crawford研究了雙孢菇采后儲(chǔ)藏期間的絲氨酸蛋白酶的表達(dá)，研究表明在剛采后鮮菇中該酶沒有表達(dá)，而之后儲(chǔ)藏第1天時(shí)被檢測(cè)到，且在第2～3天表達(dá)量達(dá)到峰值。Burton證明了該酶表達(dá)量增高后的24h酶活才會(huì)升高，在第5天表達(dá)量顯著降低但是仍然有高的酶活性[9]。相對(duì)高的轉(zhuǎn)錄和高的翻譯水平證明了該酶在食用菌衰老過程中的代謝起到了至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)定量測(cè)定了2個(gè)處理組的草菇子實(shí)體絲氨酸蛋白酶基因在貯藏期的表達(dá)量，結(jié)果表明control的SER基因表達(dá)量在24h之后一直較高，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于24h的表達(dá)量，與該組蛋白酶活性呈正相關(guān)性；PVC12-6子實(shí)體的SER基因表達(dá)量在整個(gè)貯藏期內(nèi)較低，在48h出現(xiàn)了小高峰之后急速下降，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于24h的表達(dá)量，這與該組的蛋白酶活性較低呈正相關(guān)性；2個(gè)處理組的SER基因表達(dá)量在48h都存在一個(gè)高峰，且蛋白酶活性都在96h存在高峰，此結(jié)果與Crawford和Burton研究的結(jié)果一致，即酶活性的高峰期（96h）都是在其基因表達(dá)量高峰期（48h）1～2d后才出現(xiàn)。

由本次實(shí)驗(yàn)表明，草菇在貯藏期的蛋白酶活性越高其腐爛越快，且在貯藏期的蛋白酶活性變化與該酶的基因表達(dá)量呈正相關(guān)性，即蛋白酶表達(dá)量越高則酶活越高，這為今后從分子水平調(diào)控酶基因的表達(dá)量方面來研究如何抑制生理性酶活，從而為延緩腐爛、延長(zhǎng)保鮮期奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]楊淑云，劉朝貴，曹必好，等.草菇采后生理及保鮮技術(shù)[J].生物學(xué)雜志，2002，19（4）：35-38.

[2]Burton K.S.，Partis M.D.，Wood D.A.，et al.Accumulation of serine proteinase in senescent sporophores of the cultivated mushroom，Agaricus bisporus[J].Mycol.Res，1997，101：146–152.

[3]Chavira R.Jr.，Burnett T.J.，Hageman J.H.Assaying proteinases with azocoll.Anal[J].Biochem，1984，136：446-450.

[4]汪虹，陳明杰.草菇冷誘導(dǎo)Cor3基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建[J].食用菌學(xué)報(bào)，2007，15（3）：16-19.

[5]Hammond J.B.W.，R.Nichols.Changes in respiration and soluble carbohydrates during the post-harvest storage of mushrooms（Agaricus bisporus） [J].Sci.Food.Agric，1975，26：835-842.

[6]Burton K.S.，Love M.E.，Smith J.F.Biochemical changes associated with mushroom quality on Agaricus spp[J].Enzyme Microb.Technol.，1993，15：736–741.

[7]Crawford s.Kingsnorth，Daniel C.Eastwood，Kerry S.Burton.Cloning and Postharvest Expression of Serine Proteinase Transcripts in the Cultivated Mushroom Agaricus bisporus[J].Fungal Genetics and Biology，2001，32：135-144.

[8]Burton K.S.，Smith J.F.，Wood D.A.，et al.Mycelial proteinases of the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J].Mycol.Res.，1997：1341-1347.

[9]巫光宏，詹福建，錢春梅，等.不同溫度處理對(duì)草菇、真姬菇蛋白酶活性變化的影晌[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，25（2）：71-74. （責(zé)編：張宏民）