陳 穎，樂(lè) 利，羅永亞，楊 華，汪南陽(yáng)，林芳芝，王俊霖

（南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，南京210037）

胞外蛋白（extracellular proteins，ECP）又被叫做細(xì)胞壁蛋白（cell wall proteins，CWPs），質(zhì)外體蛋白（apoplastic proteins，APPs）和分泌蛋白［1］，是質(zhì)外體中對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵調(diào)控作用的物質(zhì)，通常在高爾基體內(nèi)合成，被分泌到細(xì)胞壁及胞外的基質(zhì)中，只占質(zhì)外體所有成分的5%～10%。但胞外蛋白是胞外信號(hào)的感知者，是信號(hào)跨越細(xì)胞膜的傳遞者，又是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)骨架的搭建者。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明胞外蛋白與細(xì)胞骨架、胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜及胞內(nèi)物質(zhì)之間不斷地進(jìn)行著“交流”［2－3］。

根據(jù)其與細(xì)胞壁成分的結(jié)合度可將胞外蛋白分為三類：一類是松散型結(jié)合蛋白，主要屬于調(diào)控細(xì)胞壁生長(zhǎng)分化的酶類；第二類胞外蛋白稱為弱結(jié)合型蛋白，是以弱的非共價(jià)鍵與細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合的蛋白，在胞外可以進(jìn)行擴(kuò)散和遷移，因與細(xì)胞的生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答有關(guān)，又稱為防御蛋白；第三類胞外蛋白與胞壁成分結(jié)合緊密，稱為緊密結(jié)合型蛋白，因與細(xì)胞壁的框架構(gòu)建有關(guān)，又稱為壁結(jié)構(gòu)蛋白［4］。把胞外蛋白稱“質(zhì)外體蛋白”的學(xué)者偏于前兩類蛋白的研究，而把胞外蛋白稱“細(xì)胞壁蛋白”的學(xué)者大都偏向于二、三類蛋白的研究。本研究把葉片細(xì)胞壁提取的蛋白叫做細(xì)胞壁蛋白（CPWs），把從莖段液流中提取的蛋白叫做質(zhì)外體蛋白（APPs）。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在細(xì)胞膜、細(xì)胞器（線粒體和葉綠體中）的研究相對(duì)較多，而由于人們對(duì)胞外蛋白作用的忽視及提取的困難使其研究落后于胞內(nèi)蛋白。目前對(duì)胞外蛋白組的研究主要集中在模式植物擬南芥上［4］，另外在甘藍(lán)、紫花苜蓿、煙草、玉米、鷹嘴豆、葡萄、水稻、豌豆、黃瓜等農(nóng)作物和蔬菜上也有所涉及［5－11］，但胞外蛋白組學(xué)在林木上的研究相對(duì)較少。

楊屬植物（Populus）是林木基因組研究的模式植物，具有基因組小、童期短、生長(zhǎng)快、易轉(zhuǎn)化、易再生等特點(diǎn)，是當(dāng)今世界中緯度地區(qū)栽培面積最廣、木材產(chǎn)量最多的樹(shù)種之一，中國(guó)種植面積就已超過(guò)7×106hm2［12］。目前楊樹(shù)基因組學(xué)的研究較為深入，在環(huán)境脅迫下胞外蛋白組的研究卻相對(duì)較少。通過(guò)對(duì)楊樹(shù)胞外蛋白組的變化研究，一方面可以揭示胞外蛋白在環(huán)境脅迫中的響應(yīng)機(jī)制，另一方面可以為其他林木胞外蛋白研究提供重要的理論和技術(shù)指導(dǎo)。本研究以美洲黑楊雜種優(yōu)良無(wú)性系‘NL895’（Populusdeltoides×Populuseuramericanacv.）組培苗的葉片和莖段為試材，對(duì)楊樹(shù)胞外蛋白的提取、分離、純化、單向和雙向電泳檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。其中葉片胞外蛋白（細(xì)胞壁蛋白）的提取采用了LiCl和CaCl2法，莖段胞外蛋白（木質(zhì)部液流蛋白）的提取采用了真空滲入法，初步建立了楊樹(shù)胞外蛋白的雙向電泳研究體系。

1 材料和方法

1.1 材 料

美洲黑楊雜種優(yōu)良無(wú)性系NL895楊組培苗葉片和莖段來(lái)自于南京林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 苗木的擴(kuò)繁和培養(yǎng)

組培苗的擴(kuò)繁方法參照文獻(xiàn)［13］，蛋白提取等試驗(yàn)材料取自組培苗的莖段和葉片（圖版Ⅰ，A、B）。

1.3 楊樹(shù)葉片胞外蛋白的提取與純化

楊樹(shù)葉片胞外蛋白提取參照Kong等［8］、朱畇昊等［11］、Feiz等［14］提取法加以改進(jìn)，分兩步提取，具體流程如下。

細(xì)胞壁（CW）提?。海?）將NL895楊葉片用液氮研磨成粉末，加適量5mmol·L－1醋酸鈉（pH 4.6）溶解，然后轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，在4℃、6 000×g（Beckman CoulterTM）離心15min，重復(fù)1次上述操作。（2）將沉淀轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入含0.4mol·L－1蔗糖的醋酸鈉溶液（5 mmol·L－1，pH 4.6）中搖勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀（XO－1000D）將細(xì)胞破碎，共3次，每次10min，并對(duì)破碎后的細(xì)胞粉碎程度進(jìn)行鏡檢。破碎后的細(xì)胞在4 ℃、4 000×g離心15min，棄上清。（3）上述沉淀中依次加入含0.4、0.6、1.0mol·L－1蔗糖的醋酸鈉溶液（1mol·L－1）各沖洗3次，每次在4 ℃、4 000×g離心15min，棄上清。（4）沉淀再用5mmol·L－1醋酸鈉溶液（pH 4.6）洗滌6次，洗滌后每次4 ℃、4 000×g離心15 min。（5）棄上清，沉淀再用超純水沖洗4 次，沖洗后每次在4℃、4 000×g離心15min，最后一次在4℃、12 000×g 離心30 min，棄上清，其沉淀放入－20 ℃冷凍干燥即得細(xì)胞壁組分。

酚－甲醇／醋酸銨沉淀法胞外蛋白（ECPs）的提取與純化：（1）弱鍵結(jié)合的CWPs提取。上述細(xì)胞壁沉淀中加入0.2mol·L－1CaCl2醋酸鈉溶液（pH 4.6）沖洗2次，每次在4 000×g離心15min。（2）緊密型結(jié)合型CWPs提取。提取的細(xì)胞壁沉淀加入含0.2mol·L－1LiCl的醋酸鈉溶液（pH 4.6）沖洗2次，每次在4 000×g離心15min，以下兩者提取的步驟相同。（3）合并2次上清液，加入1／3體積Tris－平衡酚混勻，吸取苯酚相，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入5倍體積0.1 mol·L－1乙酸銨／甲醇溶液混勻，于－20 ℃條件下沉淀過(guò)夜。（4）次日將沉淀在4℃、12 000×g離心20min，棄上清加入2倍沉淀體積的甲醇，漩渦震蕩2min，12 000×g離心20min。（5）棄上清，加入2倍沉淀體積的丙酮，漩渦震蕩2 min，12 000×g離心20min。重復(fù)1次該操作，最后沉淀于－20 ℃冰箱中冷凍干燥，干粉即為細(xì)胞壁蛋白質(zhì)（CWPs），－70 ℃保存。

TCA／丙酮沉淀法胞外蛋白（ECPs）的提取與純化：參照林梓浩等［6］和Komatsu等［15］法，在提取的細(xì)胞壁組分中加入含0.2 mol·L－1CaCl2的醋酸鈉緩沖液（25mmol·L－1，pH 4.6），渦旋5min，于4 ℃冰箱中浸提3h，4℃下15 000×g離心30min，留取上清液。該步驟重復(fù)1次后，再加入含3mol·L－1LiCl的醋酸鈉緩沖液（25mmol·L－1，pH 4.6）15mL，渦旋5min，4 ℃冰箱中浸提3h后，4 ℃下15 000×g離心30min。取上清液加入4倍體積預(yù)冷的10% TCA／丙酮溶液（內(nèi)含0.1% DTT，1 mmol·L－1PMSF），并在－20 ℃冰箱沉降過(guò)夜，4℃下15 000×g離心30min，棄上清，沉淀用丙酮清洗3次，每次4 ℃下15 000×g離心30 min，棄上清，沉淀于－20 ℃冰箱中冷凍干燥，干粉即為細(xì)胞壁粗蛋白（CWPs）。

1.4 楊樹(shù)莖段胞外蛋白提取

參照Dani等［16］與Zhu等［17］的真空滲入法，并加以改進(jìn)。（1）稱取適量楊樹(shù)莖段剪成2cm 長(zhǎng)小段，用超純水漂洗和分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白的含量。（2）將漂洗好的莖段浸入20mmol·L－1醋酸鈉（含20mmol·L－1CaCl2）液體中，用70kPa真空抽氣泵抽氣20min，然后在5min內(nèi)慢慢放氣至室內(nèi)大氣壓，將莖段取出吸干表面水分，并剪除兩端褐化部分。（3）將材料放入底端帶孔的離心管中，將其套入另一個(gè)大的離心管內(nèi)，4 ℃、3 000×g離心60min，收集離心管底部的胞外提取液。（4）向提取液中加入1.5倍體積預(yù)冷的甲醇（含1%冰乙酸），在－28℃下浸提過(guò)夜。（5）次日，4 ℃、3 500×g 離心30 min，收集沉淀，依次用100%、70%甲醇洗滌沉淀，去除甲醇后的胞外蛋白粉在－70 ℃保存（即質(zhì)外體蛋白，APPs）。

1.5 細(xì)胞壁顯微檢測(cè)與胞外蛋白質(zhì)含量測(cè)定

用1.0%碘－碘化鉀染色液、藍(lán)墨水染色液浸潤(rùn)超聲破碎的細(xì)胞，然后做徒手切片，并在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化情況。胞外蛋白提取液中蛋白的含量測(cè)定參照Laemmli［18］法進(jìn)行，用牛血清白蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.6 楊樹(shù)胞內(nèi)酶（蛋白）污染的檢測(cè)

為防止提取液中胞內(nèi)蛋白的污染，采用細(xì)胞內(nèi)6－P－葡萄糖（G－6－PDH）脫氫酶活性測(cè)定法（胞內(nèi)標(biāo)志酶）檢測(cè)胞質(zhì)蛋白的污染率。參照Komatsu等［15］與Zhou等［19］法，向100μL 莖 段 胞 外 蛋 白 質(zhì)提取液、葉片細(xì)胞壁蛋白提取液和葉片總蛋白提取液中分別加入2.9mL 含55mmol·L－1Tris－HCl（8.0）、3.3 mmol·L－1MgCl2、0.2 mmol·L－1NADP、3.3mmol·L－1G－6P（6－P－葡萄糖）的混合液，在340nm 處檢測(cè)G－6－PDH 脫氫酶的活性。用胞外蛋白提取液中G－6－PDH 脫氫酶活性占總蛋白提取液中G－6－PDH 脫氫酶活性的百分比來(lái)檢測(cè)提取的胞外蛋白是否有胞內(nèi)蛋白污染，重復(fù)3次。

1.7 楊樹(shù)胞外蛋白的1－D和2－D電泳分析

1.7.1 胞外蛋白樣品處理及1－D 電泳分析 樣品的處理：將提取的胞外蛋白加入樣品處理液混勻，在沸水浴中煮5min，冷卻后在4 ℃、12 000×g下離心15min，取上清液點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS－PAGE 電泳分析。分離膠濃度12.9%，初始電壓80V，15min后改為200V 恒壓，至溴酚蘭遷移到距凝膠底部約1～2cm 時(shí)終止電泳。用PD Quest 1－DE 7.4.0圖像處理軟件進(jìn)行圖譜分析。

1.7.2 2－D 電泳體系優(yōu)化 2－D 電泳參照林梓浩等［6］的方法并加以改進(jìn)。（1）等電聚焦（IEF）：按10 μL／mg胞外蛋白含量加入蛋白裂解液［含7 mol·L－1尿素，2 mol·L－1硫脲，4% Chaps，1% DTT，2% Ampholyte（pH 3～10），1mmol·L－1PMSF］，充分搖勻后進(jìn)行超聲波處理20 min；37 ℃水浴45 min，12 000×g離心15min，取上清液150μL，加入300μL溶脹液［含6mol·L－1尿素，2mol·L－1硫脲，2%Chaps，0.4%DTT，1%Ampholyte（pH 3～10）］水化上樣液，渦旋混勻。將樣品液加入IPG strip聚焦盤中，再放入IPG 膠條（GE Healthcare），滴加2～3mL 礦物油水化12h 后，在等電聚焦儀（Bio－Rad）上進(jìn)行第一向等電聚焦電泳（IEF）。IEF聚焦參數(shù)為250V 慢速升壓45min，1 000V 快速升壓1h45min，10 000V 線性升壓5h，10 000V非線性快速升壓聚焦，使總聚焦伏特小時(shí)數(shù)達(dá)60 000Vh完成聚焦，最后為500V 保持任意時(shí)間，水化和聚焦溫度為20 ℃。（2）平衡：等電聚焦結(jié)束后，將膠條在平衡液Ⅰ［內(nèi)含50mmol／L Tris－HCl（pH 8.8），6 mol·L－1尿素，30%甘油，20g·L－1SDS，20g·L－1DTT］中振蕩平衡15 min，再在平衡液Ⅱ［內(nèi)含50mmol·L－1Tris－HCl（pH 8.8），6 mol·L－1尿素，30%甘油，20g·L－1SDS，25g·L－1碘乙酰胺］中振蕩平衡15 min。（3）第二向SDS－PAGE：同1－D 電泳操作步驟。（4）凝膠蛋白染色：SDS－PAGE結(jié)束后，取出凝膠，用去離子水漂洗2～3次，加入適量的R－250染色液，于搖床上輕輕染色3h，隨后用脫色液洗脫至背景清晰。

1.8 楊樹(shù)胞外蛋白電泳圖譜分析

顯色后的凝膠用ChemiDoc XRS 凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）掃描獲取圖像。單向電泳采用Quantity One 1－D 分析軟件進(jìn)行條帶的識(shí)別和分析。雙向電泳采用PDQuest 2－DE 7.4.0對(duì)圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)葉片細(xì)胞壁破碎程度檢測(cè)及顯微檢測(cè)

細(xì)胞壁的提取與葉片的破碎程度有關(guān)，葉片越破碎，細(xì)胞壁越易提取出來(lái)。在圖版Ⅰ，C～E 中，在用液氮研磨后的葉片進(jìn)行光鏡檢測(cè)時(shí)，可以看到葉片組織塊較大，破碎程度小（圖版Ⅰ，C）；經(jīng)超聲破處理5 min 后，葉片組織塊開(kāi)始變?。▓D版Ⅰ，D），當(dāng)超聲破處理10min后，葉片已成為非常小的碎片，這對(duì)后面的細(xì)胞壁蛋白的提取是有利的，因此在細(xì)胞壁的提取過(guò)程選擇超聲波處理10min效果較好（圖版Ⅰ，E）。

將5min 和10min超聲處理的細(xì)胞碎片懸浮液用碘化鉀和藍(lán)墨水染色后，可以看到胞內(nèi)結(jié)構(gòu)易著色，而細(xì)胞壁不易著色（圖版Ⅰ，F(xiàn)～G）。細(xì)胞破碎時(shí)間不同，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化相差很大，超聲波處理5min后，可以看到大量細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)，但胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)保留較多（圖版Ⅰ，F(xiàn)），而10min超聲破碎處理，其葉片細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)大部分已經(jīng)去除，只看到細(xì)胞壁連接而成的網(wǎng)絡(luò)，還可以觀察到大量氣孔存在，說(shuō)明10min超聲破碎清除胞內(nèi)物質(zhì)的效果較好（圖版Ⅰ，G）。

2.2 楊樹(shù)葉片胞內(nèi)蛋白污染檢測(cè)

G－6－PDH 脫氫酶是植物細(xì)胞內(nèi)呼吸過(guò)程中重要的糖代謝酶，代表植物細(xì)胞的活力程度，也是判斷細(xì)胞活力強(qiáng)弱的標(biāo)志酶，常被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞器提取液的純凈程度或污染程度［19］。從表1中可以看出，葉片細(xì)胞壁蛋白提取較純，該酶占總蛋白提取液的2.9%，而莖段質(zhì)外體蛋白提取液中該酶活性占總蛋白酶活性的14.1%，低于細(xì)胞壁提取液的純度，但仍在允許的范圍之內(nèi)。

2.3 楊樹(shù)胞外蛋白的電泳圖譜分析

2.3.1 楊樹(shù)葉片胞外蛋白SDS－PAGE分析 從圖1的C、D 泳道電泳膠中可以看出，分別用加CaCl2和LiCl提取的NL895楊葉片細(xì)胞壁蛋白條帶差異很大，CaCl2純化的蛋白較LiCl提取的蛋白條帶清晰、帶寬，而LiCl純化的胞外蛋白清晰度差，條帶數(shù)和條帶寬度都遠(yuǎn)小于CaCl2。在此提取方法中CaCl2提取的細(xì)胞壁蛋白主要是以弱鍵形式與細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白，大多屬于酶類，說(shuō)明在細(xì)胞壁的提取液中與細(xì)胞壁和胞外基質(zhì)活動(dòng)相關(guān)的酶類含量豐富，細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛（圖1，C泳道）。

從圖1中還可以看出，提取樣品葉片的質(zhì)量與提取蛋白的含量關(guān)系密切，同樣用CaCl2提取胞外蛋白的方法中，用7g（圖1，C 泳道）葉片樣品電泳的多肽條帶清晰度差，條帶彌散不集中，但用15g（圖1，B泳道）葉片量提取的蛋白與前者比較，條帶數(shù)明顯增加，條帶清晰、帶寬，可以觀察到的條帶有12～14條，分子量主要分布在13～65kD 之間，其中豐度較高的亞基分布在4 3、3 0和25kD附近。在43kD 附近有較為豐富的蛋白存在，R－250染色深，亮度大。通過(guò)與總蛋白電泳膠（圖1，A 泳道）比較，1，5－2－P核酮糖羧化酶的大亞基（55kD）在B 泳道電泳膠中非常弱，說(shuō)明細(xì)胞壁蛋白提取的純度較高（圖1，B）。而總蛋白的SDS－PAGE 圖譜中可以看到 標(biāo) 志 酶1，5－2－P 核 酮 糖 羧 化 酶 的 大 亞 基（55 kD）存在，總蛋白圖譜中多肽的條帶多于胞外蛋白的條帶數(shù)（圖1，A 泳道）。經(jīng)真空滲入法提取的莖段胞外蛋白SDS－PAGE電泳見(jiàn)圖1，E泳道，可見(jiàn)在43kD 附近有較大的多肽帶存在，在40kD 以下有少量條帶存在，而在高分子量區(qū)域50～97kD 區(qū)域中多肽條帶稀少，說(shuō)明楊樹(shù)的莖段質(zhì)外體蛋白主要分布在小分子量蛋白區(qū)域。

表1 胞外蛋白提取液中胞內(nèi)蛋白污染檢測(cè)Table1 Detection of intracellular contamination in ECPs

圖1 NL895楊胞外蛋白的1－D電泳圖譜Fig.1 SDS－PAGE image analysis of NL895poplar leaf CWPs（A－D）and stem（E）ECPs

2.3.2 楊樹(shù)葉片胞外蛋白的2－DE電泳分析

（1）不同pH 膠條和提取方法對(duì)楊樹(shù)葉片細(xì)胞壁蛋白2－DE圖譜的影響 為探究楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白最佳的pH 范圍，采用了pH 3～10和4～7、長(zhǎng)為17 cm IPG 膠條進(jìn)行研究。結(jié)果表明（圖2），從葉片提取的NL895楊細(xì)胞壁蛋白經(jīng)2－D 雙向電泳后，在不同pH 介質(zhì)中出現(xiàn)的蛋白質(zhì)多肽斑點(diǎn)差異較大。在pH 3～10介質(zhì)條件下（圖2，A），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較少，而且不清晰，統(tǒng)計(jì)斑點(diǎn)數(shù)在50個(gè)左右，大部分在43～20kD 之間。而在pH 4～7介質(zhì)條件下（圖2，C），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較pH 3～10介質(zhì)條件下增多且斑點(diǎn)清晰，且在66～45kD 之間出現(xiàn)了蛋白斑點(diǎn)，45～35kD 之間是斑點(diǎn)最密集區(qū)域，25.0～18.0kD 之間斑點(diǎn)也比較密集，蛋白點(diǎn)最密集的條帶在31kD 左右，斑點(diǎn)數(shù)最多，最清晰，經(jīng)軟件統(tǒng)計(jì)的斑點(diǎn)數(shù)達(dá)150個(gè)左右，再次說(shuō)明楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白（CaCl2）提取部分，弱堿結(jié)合的細(xì)胞壁蛋白的分子量主要分布在低分子量、酸性區(qū)域，即小分子量蛋白居多。

從上樣量來(lái)看，500μg（圖2，B）上樣量蛋白點(diǎn)較少，清晰度較差，特別是低豐度的蛋白分辨率差；1 000μg（圖2，C）上樣量無(wú)論從蛋白點(diǎn)的斑點(diǎn)數(shù)、清晰度、低豐度蛋白的表達(dá)量來(lái)講都最好，蛋白質(zhì)點(diǎn)呈圓形，重復(fù)性好，斑點(diǎn)數(shù)達(dá)300多個(gè)；而1 200μg（圖2，D）上樣量由于上樣量高，導(dǎo)致大多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)沒(méi)有完全分離，疊加在一起。

圖2 NL895楊葉片細(xì)胞壁蛋白2D 電泳圖譜（17cm IPG，pH 4～7）Fig.2 2－DE image analysis of NL895poplar CWPs extraction by andphenol－MeOH／NH4Ac（17cm IPG，pH 4～7）

盡管酚－甲醇／醋酸銨沉淀法在1 000μg上樣量、17cm 膠條、pH 4～7條件下獲得了較為滿意的蛋白質(zhì)圖譜，但由于膠條較窄，出現(xiàn)部分蛋白質(zhì)點(diǎn)的重疊和堆積，斑點(diǎn)仍然較少。在用TCA／丙酮沉淀法提取的細(xì)胞壁蛋白中，改進(jìn)了提取技術(shù)，采用加大離心力到15 000×g、延長(zhǎng)離心至30min，并在提取液中添加DTT 和PMSF，使細(xì)胞壁蛋白的提取效果大大增加，采用500μg（圖3）上樣量、24cm 膠條、pH 4～7條件下獲得了滿意結(jié)果，蛋白質(zhì)電泳圖譜清晰度提高，特別是蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)大大增加，斑點(diǎn)數(shù)達(dá)550多個(gè)，比酚－甲醇／醋酸銨沉淀法多了200多個(gè)斑點(diǎn)，是較為有效的一種純化方法。

圖3 NL895楊葉片丙酮沉淀法細(xì)胞壁蛋白的2D 電泳圖譜（500μg，24cm IPG，pH 4～7）Fig.3 2－DE image analysis of NL895poplar CWPs extraction by TCA／acetone precipitation（500μg，24cm IPG，pH 4～7）

（2）楊樹(shù)莖段胞外蛋白的2－D 電泳分析 NL895楊細(xì)胞壁蛋白經(jīng)2－D 電泳后，在不同pH 介質(zhì)膠條下電泳出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與在葉片中的pH范圍不同。在pH 3～10介質(zhì)條件下（圖4，A），電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較多，而且清晰，在高分子量部分70～97kD 區(qū)域也有斑點(diǎn)存在，但較少，在31～66kD 區(qū)域蛋白主要分布在pH 5～7之間的中性區(qū)域；31～43kD 之間蛋白斑點(diǎn)最多，特別是在43kD左右，蛋白斑點(diǎn)最為集中，依然說(shuō)明莖段胞外蛋白主要分布在小分子量的區(qū)域。而在pH 4～7 介質(zhì)條件下，電泳圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)并沒(méi)有表現(xiàn)出比pH 3～10之間多的現(xiàn)象，也是主要在31～66kD 之間蛋白斑點(diǎn)最多，但斑點(diǎn)堆積現(xiàn)象明顯（圖4，B）。

3 討 論

目前胞外蛋白的提取方法主要有兩種，一種是細(xì)胞毀壞型即通常采用先提取細(xì)胞壁，再?gòu)募?xì)胞壁中純化出蛋白［14－15］，主要應(yīng)用于葉片；另一種是細(xì)胞非毀壞型即通過(guò)真空滲入法［17，19］將胞外蛋白提取出來(lái)，主要應(yīng)用于莖段。不同植物胞外蛋白的提取技術(shù)相差很大，在本研究中葉片細(xì)胞壁蛋白采用了第一種方法，在細(xì)胞壁的超聲破碎過(guò)程中，10 min超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎程度最好，超聲波處理后溶液明顯比處理前溶液均勻，且粉末更加細(xì)致，這樣大大增加了與提取液接觸面積，進(jìn)而提高了蛋白樣品質(zhì)量。通過(guò)染色鏡檢葉肉細(xì)胞中的胞內(nèi)物質(zhì)，可看出該法已將其大部分去除，檢測(cè)到大部分結(jié)構(gòu)為去除胞內(nèi)成分的細(xì)胞壁，結(jié)果與朱畇昊等［11］的方法一致，證明該法對(duì)細(xì)胞壁的破碎是可行的。用真空滲入法提取葉片胞外蛋白時(shí)，由于楊樹(shù)葉片汁液流動(dòng)不及農(nóng)作物，因而提取的胞外蛋白量非常少，需要大量的葉片材料（資料未給出），因此利用前一種方法提取葉片胞外蛋白較好。在莖段質(zhì)外體液流蛋白的提取過(guò)程中，采用了多年生實(shí)生苗楊樹(shù)（春季嫩梢）和組培苗的莖段提取作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗由于枝條較粗且已木質(zhì)化，酚氧化酶活性強(qiáng)，在提取過(guò)程中亦褐化，給提取質(zhì)外體液流蛋白帶來(lái)困難（資料未給出），而利用組培苗的幼嫩莖段提取質(zhì)外體液流蛋白，其效果較好。

圖4 NL895楊莖段胞外蛋白雙向電泳圖Fig.4 2－DE image analysis of NL895poplar apopalst proteins from stems

在樣品的用量方面，大部分文獻(xiàn)中通常介紹樣品量在5～10g之間，但在楊樹(shù)胞外蛋白提取過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)低量（7g左右），只有用CaCl2純化的蛋白多肽條帶清晰，用LiCl提取的蛋白電泳后條帶不清晰，濃度低，不能用于分析。采用高質(zhì)量（10g 以上）樣品提取的胞外蛋白條帶清晰、帶寬、濃度高，說(shuō)明楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白的提取需要較高的樣品用量，這與林梓浩等［6］在黃瓜中細(xì)胞壁蛋白提取只用5g的量相差很大，說(shuō)明不同的植物細(xì)胞壁蛋白具有特異性，另外也可能與提取的方法有關(guān)。

在蛋白純化中，采用的方法主要有丙酮干粉法和飽和酚法。酚－甲醇／醋酸銨沉淀法主要是用于從富含次生代謝物的復(fù)雜樣品中提取蛋白質(zhì)的方法［20］；在酚－甲醇／醋酸銨沉淀法中本實(shí)驗(yàn)獲得了300多個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，提取效果較好，與黃雅芳等［21］結(jié)果相似；而采用丙酮／沉淀法純化的細(xì)胞壁蛋白效果要好于上述方法，且采用24cm 的大膠條更有利于楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白斑點(diǎn)的展現(xiàn)，斑點(diǎn)達(dá)550個(gè)，是較為理想的純化方法。在本研究中影響雙向電泳蛋白斑點(diǎn)數(shù)量和清晰度的因素主要有2 個(gè)：一是膠條pH 范圍，pH4～7膠條對(duì)楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白的分辨率較有利，分離出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)多而密集、清晰度高，減少了蛋白斑點(diǎn)的堆積和重疊，而用pH 3～10 膠條蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較少，低豐度蛋白不清晰，蛋白斑點(diǎn)堆積、重疊。相反，莖段質(zhì)外體蛋白采用pH 3～10的膠條效果更好，說(shuō)明不同器官之間蛋白質(zhì)分子量區(qū)域有差異，需要的pH 值也不同。二是膠條長(zhǎng)度，采用24cm 膠條比17cm 的膠條得到的蛋白斑點(diǎn)多。

楊樹(shù)是林木研究的模式樹(shù)種，而胞外蛋白在應(yīng)答環(huán)境脅迫和環(huán)境適應(yīng)性中具有非常重要的作用［3］。本研究利用NL895楊組培苗的葉片和莖段初步建立了楊樹(shù)胞外蛋白的雙向電泳技術(shù)體系，為開(kāi)展楊樹(shù)細(xì)胞壁蛋白的研究提供了前提條件，為差異蛋白的分析奠定了基礎(chǔ)。莖段質(zhì)外體蛋白的提取、純化的方法還需進(jìn)一步完善和探索。

圖版Ⅰ NL895楊組培苗（A、B）、葉片細(xì)胞碎片超聲波處理（C～E）及超聲波葉碎片顯微檢測(cè)（F、G）PlateⅠ Plantlets of NL895poplar（A，B）；detection of the cell breaking status by microscopic（C－G）

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