王大寧，張麗，劉亞靜，魏希，夏寧邵,4，李少偉,4Δ

(1.廈門(mén)大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院/分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102；2.廈門(mén)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102；3.廈門(mén)萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司，福建 廈門(mén) 361000；4.廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361102)

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基于假病毒的人乳頭瘤病毒小鼠感染模型的建立及HPV16 VLP疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)

王大寧1，張麗2，劉亞靜1，魏希3，夏寧邵1,4，李少偉1,4Δ

(1.廈門(mén)大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院/分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102；2.廈門(mén)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102；3.廈門(mén)萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司，福建 廈門(mén) 361000；4.廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361102)

目的 建立基于假病毒的人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)小鼠感染模型并應(yīng)用于HPV16 VLP疫苗的保護(hù)性評(píng)價(jià)。方法 利用293FT細(xì)胞制備攜帶Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒，純化后檢測(cè)HPV16假病毒滴度和性質(zhì)；利用醋酸甲羥孕酮和β-雌二醇處理雌性BAL B/c小鼠，然后用壬苯醇醚-9(N-9)化學(xué)損傷BALB/c小鼠陰道，6 h后用HPV16假病毒感染小鼠陰道，48 h后使用活體檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠陰道中Luc報(bào)告基因的表達(dá)情況；最后，利用該感染模型評(píng)價(jià)HPV16 VLP疫苗的保護(hù)能力。結(jié)果 獲得了含有Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒，建立了HPV假病毒純化方法；Western blot結(jié)果顯示HPV16假病毒中含有L1和L2蛋白；建立了HPV假病毒感染小鼠模型，并通過(guò)不同劑量的假病毒感染實(shí)驗(yàn)表明，該感染模型所需的最低假病毒劑量是1.7×104TRLU；利用該模型獲知HPV16 VLP疫苗具有較強(qiáng)的抵抗HPV16假病毒感染的能力，當(dāng)中和抗體滴度為256時(shí)即可阻礙HPV假病毒感染。結(jié)論 本研究成功地建立了HPV假病毒小鼠感染模型，并運(yùn)用該模型評(píng)價(jià)了HPV16 VLP疫苗的保護(hù)作用，為HPV中和抗體研究和候選疫苗的免疫保護(hù)評(píng)價(jià)提供了有效工具。

人乳頭瘤病毒；假病毒；小鼠感染模型；中和保護(hù)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染能引起宮頸癌、尖銳濕疣等多種疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康[1]。人乳頭瘤病毒疫苗是預(yù)防HPV感染以及相關(guān)疾病的有效手段[2]。目前世界上已有3種HPV疫苗上市，即Merck公司Gardasil(HPV6/11/16/18四價(jià)疫苗)和Gardasil 9(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九價(jià)疫苗)以及GSK公司Cervarix(HPV16/18二價(jià)疫苗[3]。國(guó)內(nèi)也有企業(yè)正在積極進(jìn)行HPV預(yù)防性疫苗的研制，并有多家企業(yè)產(chǎn)品進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段[4-6]。

免疫原性評(píng)價(jià)是HPV預(yù)防性疫苗臨床研究中的重要內(nèi)容。目前廣泛采用的假病毒-細(xì)胞中和法能夠直接檢測(cè)具有中和活性的所有抗體，且不受抗原表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的影響[7-8]。但該方法使用人腎細(xì)胞作為受體細(xì)胞，只能在細(xì)胞水平上檢測(cè)血清是否具有阻礙假病毒感染的能力。無(wú)法真實(shí)模擬在體內(nèi)復(fù)雜的陰道、子宮頸等微環(huán)境中，具有組織特異性的HPV感染及其被中和的情況，對(duì)疫苗的臨床評(píng)價(jià)具有一定的局限性。因此，亟需發(fā)展一種能更真實(shí)模擬HPV感染的動(dòng)物體內(nèi)模型，用于HPV預(yù)防性疫苗免疫保護(hù)評(píng)價(jià)、HPV中和抗體研究、HPV疫苗的主動(dòng)免疫和HPV感染研究。

本研究旨在以假病毒-細(xì)胞中和法為基礎(chǔ)制備以luc基因作為報(bào)告基因的HPV16假病毒，并對(duì)該假病毒進(jìn)行了性質(zhì)檢測(cè)以及定量；并基于該假病毒建立HPV假病毒感染小鼠陰道模型，以進(jìn)一步優(yōu)化假病毒感染小鼠陰道的假病毒用量，另使用該方法評(píng)價(jià)不同劑量HPV16疫苗的保護(hù)能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞： DH5α株大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)保藏；AAV-HPV16 L1、AAV-HPV16 L2和pN31-EGFP質(zhì)粒由J.T.Schiller教授惠贈(zèng)[9]；表達(dá)luciferase質(zhì)粒(PST-luc)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；293FT細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HPV16 L1抗體PD4和8A9 以及HPV16 L2抗體14H6由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；HPV16 VLP疫苗與鋁佐劑為本實(shí)驗(yàn)室制備[10]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取4～6周齡，體質(zhì)量約20g的BALB/c小鼠(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，飼養(yǎng)于廈門(mén)大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》，得到本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(閩)2013-0001。

1.1.3 試劑： PEI轉(zhuǎn)染專(zhuān)用試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清(Fetal Calf Serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自德國(guó)PAA公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)購(gòu)自AppliChem公司；三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)、熒光素酶(D-luciferase)、β-雌二醇(β-Estradiol)、壬苯醇醚(Nonoxynol-9，N-9)和羥甲基纖維素(Carboxymethylcellulose，CMC)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；醫(yī)用醋酸甲羥孕注射液(DepoProvera)購(gòu)自廈門(mén)中山醫(yī)院。

1.1.4 儀器：AKTA純化設(shè)備， AKTA purifier，美國(guó)GE公司；透射電鏡，Tecnai G2 Spirit，美國(guó)FEI公司；酶標(biāo)儀，PHOMO，安圖實(shí)驗(yàn)儀器(鄭州)有限公司；Xenogen可見(jiàn)光小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，Ivis LuminaⅡ，Caliper Life Science。

1.2 方法

1.2.1 HPV16假病毒制備及性質(zhì)鑒定

① 聚醚酰亞胺(Polyetherimide，PEI)轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)HPV16假病毒：HPV假病毒制備方法參考已有報(bào)道[8,11-12]。簡(jiǎn)述如下：將293 FT細(xì)胞鋪于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%后，將10 μg AAV-HPV16 L1、1 μg AAV-HPV16 L2和10 μg pN31-EGFP或PST-Luc質(zhì)粒充分混勻，與PEI混合(質(zhì)粒與PEI質(zhì)量比為1:3)震蕩10s；靜置10～20 min后，將上述混合液均勻的加入預(yù)鋪的293FT細(xì)胞中，輕輕搖勻，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；4 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞，用相同體積的裂解液在37 ℃條件下裂解16 h，收集上清并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌Ep管中，再加入0.19倍(體積比)的5M NaCl，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

② HPV16假病毒純化：收獲假病毒后，使用AKTA純化設(shè)備和Core 700層析介質(zhì)純化HPV16假病毒。純化緩沖液為10 mM PB 6.5+0.5 M NaCl,Core 700層析柱經(jīng)緩沖液平衡后，將2 mL假病毒泵入層析介質(zhì)中，分段收集樣品峰進(jìn)行濃度檢測(cè)。

③ 透射電鏡觀察HPV16假病毒顆粒： 取15 μL HPV16假病毒吸附在鍍碳的通網(wǎng)上，吸附5 min，干燥，用2%pH6.4磷鎢酸染色5 min；使用FEI Tecnai G2透射電鏡觀察HPV假病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)。

④ 雙抗夾心ELISA檢測(cè)HPV16假病毒：基于本實(shí)驗(yàn)室建立的HPV VLP雙抗檢測(cè)方法，采用HPV16 L1 構(gòu)象性雙抗夾心系統(tǒng)(PD4：8A9-HRP)測(cè)量假病毒的濃度。HPV16 L1抗體PD4包被96孔ELISA板，將HPV16 VLP稀釋至1 μg/mL，加入首孔，雙孔重復(fù)，2倍梯度系列稀釋?zhuān)籋PV16假病毒稀釋100倍后加入首孔，2倍梯度系列稀釋?zhuān)?7 ℃溫育45 min，1×PBST清洗5次；加入二抗8A9-HRP(1:2000)37 ℃溫育45 min，1×PBST清洗5次；加入A，B顯色底物(北京萬(wàn)泰生物股份有限公司)在37 ℃溫育10 min后加入終止液，放置酶標(biāo)儀中使用450 nm和620 nm雙波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)HPV16 VLP在線(xiàn)性范圍內(nèi)的OD值與濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將HPV16假病毒反應(yīng)的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出假病毒的濃度(用L1蛋白濃度(μg/mL)表示)。

⑤ Western blot分析HPV16假病毒：取100 μL純化后的HPV16假病毒，加入20 μL 6×蛋白上樣緩沖液(100 mM pH6.8 Tris-HCl，200 mM BME，4%SDS，0.2%溴酚藍(lán)和20%甘油)，80 ℃加熱10 min，10%SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，加入5%脫脂奶封閉1 h，加入HPV16 L1抗體21A5和HPV16 L2抗體14H6[12]室溫反應(yīng)1 h，加入含0.2%Tween-20的PBS清洗3次；加入二抗(HRP標(biāo)記的驢抗鼠)反應(yīng)1 h，清洗3次，曝光顯色。

1.2.2 HPV16假病毒滴度鑒定：收獲假病毒后將其感染293FT細(xì)胞進(jìn)行滴度鑒定，細(xì)胞感染在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。①含GFP報(bào)告基因的假病毒滴度鑒定：采用TCID50法進(jìn)行檢測(cè)，假病毒10倍梯度倍稀，稀釋6個(gè)梯度， 每個(gè)稀釋倍數(shù)8孔重復(fù)，熒光Elispot檢測(cè)每孔感染情況，計(jì)算出假病毒的TCID50；② 含luc報(bào)告基因的假病毒滴度鑒定：首孔將假病毒稀釋至50 g/mL，8孔重復(fù)，依次2倍倍稀釋?zhuān)腥炯?xì)胞48 h后用活體成像儀檢測(cè)，計(jì)算假病毒稀釋前滴度，滴度單位為T(mén)RLU/mL。TRLU(transducing relative light units)是能使細(xì)胞產(chǎn)生熒光信號(hào)的假病毒最高稀釋濃度的倒數(shù)。

1.2.3 假病毒感染小鼠陰道模型的建立及不同假病毒用量對(duì)感染的影響

① 假病毒感染小鼠陰道模型的建立：假病毒感染小鼠陰道之前，先用β-雌二醇和醋酸甲羥孕酮(DepoProvera)使小鼠進(jìn)入動(dòng)情期。即每只小鼠皮下注射0.1 μg β-雌二醇，24 h后每只小鼠再皮下注射3 mg 醋酸甲羥孕酮。12 h后，用氣體麻醉系統(tǒng)(XGI-8)麻醉小鼠，將50 μL 4%(v:v)N-9灌入小鼠陰道內(nèi)進(jìn)行化學(xué)損傷。6 h后，取25 μL HPV16假病毒與15 μL 4%CMC的混合物灌入小鼠陰道內(nèi)進(jìn)行感染，對(duì)照組小鼠只灌入40 μL 4%CMC進(jìn)行處理；假病毒感染48 h之后，麻醉小鼠，取50 μL 15 mg/mL D-Luciferase灌入小鼠陰道內(nèi)促使小鼠陰道上皮細(xì)胞內(nèi)的luc發(fā)光，3 min后利用Xenogen小動(dòng)物體內(nèi)可見(jiàn)光成像系統(tǒng)(IVIS，Caliper Life Science)檢測(cè)小鼠體內(nèi)熒光素酶的表達(dá)情況。在HPV16 VLP疫苗保護(hù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，疫苗免疫8周后，用β-雌二醇和醋酸甲羥孕酮處理小鼠，然后按照上述流程進(jìn)行小鼠陰道感染和熒光檢測(cè)。

② 為研究HPV假病毒使用劑量對(duì)感染結(jié)果的影響，及在已知假病毒滴度下最的低感染劑量，設(shè)計(jì)5個(gè)不同的感染劑量，分別是5、10、15、20、25 μL，每個(gè)劑量3只小鼠，對(duì)照組3只小鼠感染PBS。假病毒感染48 h后，活體成像儀檢測(cè)感染結(jié)果。

1.2.4 HPV6 VLP疫苗免疫阻礙HPV16假病毒感染小鼠陰道

① HPV16 VLP疫苗免疫小鼠：將16只4～6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，分別免疫100、33.3、11.1 ng的HPV16 VLP疫苗[10]和鋁佐劑(作為陰性對(duì)照)，每組4只。免疫程序是分別在0、2、4周進(jìn)行免疫，共3次。首次接種第8周后眼眶采血檢測(cè)各組小鼠血清中HPV16的中和抗體滴度。

② 免疫血清中和滴度檢測(cè)：血清中和檢測(cè)方法參考已有報(bào)道[13]，簡(jiǎn)述如下，將293FT細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔的密度鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)4～6 h。血清用含10%FBS的DMEM稀釋1000倍后加入96孔U型板首孔，再用10%FBS DMEM進(jìn)行2倍梯度稀釋。取60 μL稀釋后的血清分別與60 μL用10%DMEM稀釋后的HPV16假病毒(攜帶GFP報(bào)告基因)混合，室溫孵育1 h后取100 μL加入預(yù)鋪有293FT細(xì)胞的96孔板中，37 ℃培養(yǎng)72 h后先在熒光顯微鏡下觀察，再用熒光Elisopt檢測(cè)各孔細(xì)胞的感染率，計(jì)算血清的中和滴度。感染率=細(xì)胞樣品在陽(yáng)性區(qū)中的細(xì)胞數(shù)量百分率-未感染的對(duì)照細(xì)胞樣品在陽(yáng)性區(qū)的數(shù)量百分率。感染抑制率=(1-阻斷孔的感染率/未阻斷孔的感染率)×100%。血清中和滴度的定義為：達(dá)到高于50%感染抑制率的最大稀釋倍數(shù)。經(jīng)過(guò)稀釋后能達(dá)到50%以上感染抑制率的單抗或多抗被視為具有中和能力。

2 結(jié)果

2.1 攜帶Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒制備及性質(zhì)鑒定

2.1.1 攜帶Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒制備：透射電鏡觀察結(jié)果顯示：假病毒被細(xì)胞內(nèi)的雜蛋白包圍，假病毒純度較低，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1A。經(jīng)Core 700層析純化后，HPV16假病毒純度顯著提高，雜蛋白明顯減少，HPV16假病毒的顆粒形態(tài)更加清晰，假病毒顆粒規(guī)則飽滿(mǎn)，大小均一，直徑約60 nm，見(jiàn)圖1B。

圖1 透射電鏡觀察HPV16假病毒(×25,000) A：純化前；B：Core 700 層析純化后Fig.1 TEM visualization of HPV16 pseudovirus(×25,000)A:Before purified;B:After purified by Core 700 chromatography

2.1.2 HPV16假病毒定量和定性檢測(cè)：雙抗夾心系統(tǒng)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為“Y=0.0093X+0.1869”，見(jiàn)圖2A。計(jì)算出假病毒中L1的濃度是20.5 μg/mL。Western blot結(jié)果顯示純化后的假病毒中也含有L2蛋白，但L1的含量明顯高于L2的含量，見(jiàn)圖2B。L2蛋白理論分子量約為50 kDa，而電泳結(jié)果顯示L2蛋白條帶位于70 kDa左右，這與目前報(bào)道的結(jié)果一致[14]。

圖2 HPV16假病毒定量和定性檢測(cè) A：雙抗夾心測(cè)量L1含量；B：Western blot檢測(cè)HPV16假病毒Fig.2 Quantity and quality assay for HPV16 pseudovirusA:double-antibody sandwich ELISA for detecting HPV16 pseudovirus；B:L1 and L2 of HPV16 pseudovirus detected by Western blot

2.2 攜帶Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒感染滴度測(cè)定 根據(jù)活體成像儀檢測(cè)的熒光信號(hào)強(qiáng)度讀值和假病毒稀釋倍數(shù)，計(jì)算出假病毒稀釋前滴度為8.84×105TRLU/mL。

2.3 假病毒感染小鼠陰道模型的建立及不同假病毒用量對(duì)感染的影響

2.3.1 假病毒感染小鼠陰道模型的建立：活體成像儀結(jié)果顯示：HPV16假病毒成功感染小鼠陰道組織，見(jiàn)圖3B。對(duì)照組沒(méi)有熒光信號(hào)，見(jiàn)圖3A。為檢測(cè)該熒光信號(hào)的持久性，每隔3 min檢測(cè)一次，連續(xù)檢測(cè)12次，發(fā)現(xiàn)加入熒光素酶底物15～20 min后信號(hào)達(dá)到較高值，熒光信號(hào)可持續(xù)近40 min，見(jiàn)圖3C。

圖3 活體成像儀檢測(cè)HPV16假病毒感染小鼠陰道(n=3)A：對(duì)照組；B：感染HPV16假病毒組；C：連續(xù)測(cè)量小鼠陰道內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度Fig.3 In vivo luminescence imaging in mouse after treatment with HPV16 PsV(n=3)A:Control; B:Treated with HPV16 PsV-Luc; C:Measured in photons/s/cm2/sr

2.3.2 不同假病毒用量對(duì)感染的影響：活體成像檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組(假病毒感染劑量為0)和HPV16假病毒感染劑量為5、10、15 μL時(shí)均未檢測(cè)出病毒感染信號(hào)，見(jiàn)圖4A、4B、4C、4D。當(dāng)HPV16假病毒感染劑量為20、25 μL時(shí)，能夠檢測(cè)到熒光信號(hào)，見(jiàn)圖4E、4G。且25 μL感染劑量組產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度要明顯高于20 μL感染劑量組，見(jiàn)圖4H。假病毒滴度為8.84×105TRLU/mL，本實(shí)驗(yàn)表明，1.7×104TRLU的HPV16假病毒即可成功感染小鼠陰道上皮組織，并能被激發(fā)出足夠的熒光被活體成像儀檢測(cè)到。為充分保證實(shí)驗(yàn)良好的再現(xiàn)性，給與2.2×104TRLU的HPV16假病毒用量。

圖4 不同劑量的HPV16假病毒感染小鼠陰道(n=3)A：對(duì)照組；B-G：感染不同劑量假病毒組；H：連續(xù)測(cè)量各組小鼠陰道內(nèi)熒光Fig.4 In vivo luminescence imaging after treatment with serial dosage of HPV16 PsV(n=3) A:Control; B-G:Treated with different dosages of HPV16 PsV-Luc;H:Measured in photons/s/cm2/sr

2.4 HPV6 VLP 疫苗免疫阻礙HPV16假病毒感染小鼠陰道 HPV16假病毒抗體中和滴度檢測(cè)結(jié)果顯示：11.1 ng疫苗接種產(chǎn)生的中和抗體滴度約為360，對(duì)照組不產(chǎn)生中和抗體，見(jiàn)圖5A。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體抵御HPV感染的能力，將含有Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒(劑量為3.0×104TRLU)感染小鼠，48 h后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：只有對(duì)照組的小鼠陰道部位出現(xiàn)明顯的感染信號(hào)，3組接種不同劑量的小鼠均沒(méi)有感染HPV16假病毒，見(jiàn)圖5B。表明HPV16 VLP疫苗具有較好的預(yù)防HPV感染的能力，HPV16疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的中和抗體滴度為256時(shí)即可完全抵御HPV16假病毒的感染。

圖5 HPV16 VLP疫苗免疫小鼠保護(hù)HPV16假病毒感染(n=4)A：不同劑量HPV16 VLP疫苗免疫后誘導(dǎo)中和抗體滴度；B：活體成像儀檢測(cè)接種不同濃度疫苗后的小鼠陰道抵御HPV16假病毒感染情況Fig.5 HPV16 VLP vaccine protection against in vivo genital HPV16 PsV infection(n=4) A:HPV16 neutralizing titers measured by HPV16 PsV in vitro neutralization assay;B：Immune sera were titrated using HPV16 PsV neutralization assay

3 討論

本文利用PEI轉(zhuǎn)染法獲得包裹Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒，利用透射電鏡和Western Blot等檢測(cè)方法表明純化后假病毒的顆粒形態(tài)飽滿(mǎn)，含有L2蛋白，與已報(bào)道的HPV16假病毒性質(zhì)一致。雙抗夾心系統(tǒng)檢測(cè)HPV16假病毒中L1蛋白含量為20.5 μg/mL，利用活體成像儀檢測(cè)HPV16假病毒感染細(xì)胞的能力是8.84×105TRLU/mL，達(dá)到進(jìn)行小鼠感染的實(shí)驗(yàn)要求。

HPV可感染受損的粘膜上皮細(xì)胞，Elenius等[[15]利用免疫組化和原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)受損的上皮細(xì)胞在進(jìn)行傷口愈合過(guò)程中，硫酸乙酰肝素(HSPG)的表達(dá)量顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)受損的小鼠陰道上皮組織可促進(jìn)HPV16假病毒的感染[16]。通過(guò)注射醋酸甲羥孕酮使小鼠進(jìn)入動(dòng)情間期，壬苯醇醚-9(N-9)化學(xué)損傷其陰道，再利用HPV16假病毒感染小鼠陰道，成功的建立了假病毒感染小鼠陰道模型，且研究表明HPV16假病毒最低感染劑量為1.7×104TRLU。

利用該假病毒感染小鼠陰道模型，證明了HPV16 VLP疫苗具有很好的保護(hù)性，疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的中和抗體為256即可完全可以抵御HPV16 假病毒的感染，同時(shí)也表明了該假病毒感染模型具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

截止2015年已有3種HPV預(yù)防性疫苗上市，疫苗上市前要經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的臨床試驗(yàn)，目前普遍采用的臨床試驗(yàn)選擇的臨床終點(diǎn)是癌前子宮頸、陰道、外陰等高度病變[17]，而HPV感染引起這些疾病的過(guò)程十分緩慢，這導(dǎo)致HPV疫苗臨床周期很長(zhǎng)，臨床試驗(yàn)成本急劇增加，同時(shí)給臨床試驗(yàn)受試者帶來(lái)較大傷害。而HPV假病毒感染小鼠陰道模型給評(píng)價(jià)HPV疫苗的保護(hù)性帶來(lái)了希望，該模型成本低，周期較短，操作簡(jiǎn)單，可以模擬HPV感染陰道上皮組織過(guò)程，因此該模型在研究HPV感染和評(píng)價(jià)疫苗保護(hù)性方面具有較大的潛力。

本研究基于HPV16假病毒建立的感染小鼠陰道模型，而能引起宮頸癌、陰道癌和肛門(mén)癌等相關(guān)疾病的HPV 型別達(dá)17種以上[18]，因此還需進(jìn)一步研究其他型別是否適用于這一感染模型。本研究對(duì)小鼠陰道的感染情況只是通過(guò)活體成像儀檢測(cè)感染產(chǎn)生的熒光信號(hào)的強(qiáng)度判斷，無(wú)法觀察假病毒感染引起的炎癥。在2013年Kines等[19]利用微型陰道鏡檢測(cè)小鼠陰道病變情況，該研究在很大程度上彌補(bǔ)了該模型的缺點(diǎn)，可以更加直觀地研究HPV感染及治療。

綜上所述，本研究基于Core 700層析純化的包裹Luc報(bào)告基因的HPV16假病毒，成功地建立了HPV假病毒小鼠感染陰道模型，為HPV預(yù)防性疫苗免疫保護(hù)評(píng)價(jià)、HPV中和抗體研究、HPV治療性疫苗開(kāi)發(fā)和HPV感染研究提供了有利條件。

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(編校：吳茜)

Establishment of human papillomavirus pseudovirion infection model in mouse for potency evaluation of HPV16 VLP Vaccine

WANG Da-ning1, ZHANG Li2, LIU Ya-jing1, WEI Min-xi3, XIA Ning-shao1,4, LI Shao-wei1,4Δ

(1.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2. School of Medicine, Xiamen University, Xiamen 3611024, China; 3. Xiamen Innovax Biotechnology Co.,Ltd., Xiamen 361000, China; 4.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

ObjectiveTo establish a mouse model of genital human papillomavirus (HPV) pseudovirion (PsV) transmission and evaluate the protective potency of HPV16 VLP vaccine.MethodsHPV16 PsV with the encapsidated luciferase expressing plasmid Luc were generated from 293FT cells and purified by size-exclusion chromatography. The endpoint titers of HPV16 PsV-Luc were determined on 293FT cells, denoted as TRLU/mL. For in vivo genital challenge, mice were synchronized in a diestrus-like status by a subcutaneous injection with 0.1 μg β-estradiol and then with 3mg DepoProvera after 24 hours. Six hours prior to HPV16 PsV-Luc challenge, deeply anesthetized mice were intravaginally pretreated with 50 μL of 4%nonoxynol-9 (N-9). HPV16 PsV-Luc was thoroughly mixed with 20 μL solution containing 4%carboxymethylcellulose (CMC) and intravaginally instilled using a positive-displacement pipette. Forty-eight hours after PsV-Luc challenge, mice were anesthetized and D luciferin was intravaginally instilled. After 3 minites, bioluminescence was measured with a cryogenically cooled Xenogen IVIS camera system. Then，the murine genital challenge model was used to determine the potency that HPV16 VLP vaccine is efficient at preventing HPV infection.ResultsHPV16 PsV-Luc was generated and purified from 293FT cells. HPV16 PsV-Luc was verified to containe L1 and L2 protein by Western blot. HPV 16 PsV-Luc successfully infected vaginal epithelial cells of mouse and the murine genital challenge model was established. To achieve consistent bioluminescence, the minimal dose of HPV16 PsV-Luc was 1.7×104TRLU. The protective potency of HPV16 VLP vaccine was shown using this murine model. Our data showed that immune serum with over neutralizing antibody titer of 256-fold was sufficient to confer protection against HPV PsV genital infection.ConclusionThe murine genital challenge model of HPV16 was successfully established, and the model is used to evaluate the potency of HPV16 VLP vaccine against in vivo genital HPV16 PsV challenge. Our model will benefit for the investigation of HPV neutralization and the potency evaluation of the HPV vaccine.

human papillomavirus; HPV pseudovirus; pseudovirion infection model; protective potency

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172885)

王大宇，男，博士在讀，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:haining411@163.com;李少偉，通信作者，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子病毒學(xué)，E-mail:shaowei@xmil.edu.cn。

R373

A

1005-1678(2015)11-0005-06