譚燕萍，朱永坤，姚暉

(1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院 藥劑科，廣東 佛山 528000；2.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 東莞 523326；3.廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部， 廣東 佛山 528000)

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大鼠腦出血后水腫組織中的PN-1、thrombin、PAR-1表達(dá)及其作用分析

譚燕萍1Δ，朱永坤2，姚暉3

(1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院 藥劑科，廣東 佛山 528000；2.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 東莞 523326；3.廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 藥學(xué)部， 廣東 佛山 528000)

目的 探討腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)實(shí)驗(yàn)大鼠水腫周圍腦組織中蛋白酶連接素-1(protease nexin-1，PN-1)、 凝血酶(thrombin)、蛋白酶激活受體-1(protease activated receptor-1，PAR-1)的表達(dá)變化及其作用分析。方法 選取成年健康雄性SD大鼠80只，編號(hào)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、ICH組，各40只。ICH組于右側(cè)尾狀核部注射自體動(dòng)脈血方法制作ICH實(shí)驗(yàn)大鼠模型，分別于術(shù)后第12、24、120 h對(duì)2組大鼠的神經(jīng)功能障礙程度進(jìn)行評(píng)價(jià)；HE染色觀察腦組織細(xì)胞中形態(tài)；Western blot分別于造模后第3、6、10、12、24、48及120 h檢測(cè)2組大鼠腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的變化情況。結(jié)果 ICH組大鼠的神經(jīng)功能障礙評(píng)分在造模后第12、48、120 h均顯著的低于假手術(shù)組(P<0.05)；ICH組大鼠在造模后第3、6、10、12、24、48及120 h的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1較假手術(shù)組均顯著的增高(P<0.05)；ICH組大鼠的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1在造模后12 h或24 h出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)較造模后10 h或12 h(P<0.05)。結(jié)論 ICH實(shí)驗(yàn)大鼠血腫周圍腦組織中PN-1有抑制thrombin及PAR-1過表達(dá)，引起神經(jīng)損傷的作用。

腦出血；大鼠；腦組織；凝血酶抑制劑

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，占全部腦卒中的20%～30%，相關(guān)臨床統(tǒng)計(jì)分析可見腦出血的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，腦出血可引起患者出現(xiàn)認(rèn)知功能、語言功能以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，嚴(yán)重降低了腦出血患者的生存質(zhì)量[1]。目前臨床上對(duì)于腦出血的內(nèi)科治療尚無特效，主要通過脫水等對(duì)癥處理。但外科治療的方法和作用仍存在爭(zhēng)議[2]。腦出血患者急性期主要表現(xiàn)為腦組織水腫，而出血部分腦組織的水腫程度對(duì)于內(nèi)、外科治療效果具有極為重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)在腦水腫組織周邊存在凝血酶的異常表達(dá)[3]。本研究重在探討凝血酶、凝血酶受體以及凝血酶抑制劑在腦出血周邊水腫組織內(nèi)的表達(dá)情況，進(jìn)而揭示凝血酶對(duì)于腦出血的診治意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取成年健康雄性SD大鼠80只(8～9周齡)，編號(hào)后隨機(jī)分為假手術(shù)組、ICH組，各40只，體質(zhì)量260～300 g，平均體質(zhì)量(272.4±13.9)g，購自廣東中山醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心(許可證號(hào)：201500002)，飼養(yǎng)于23 ℃～25 ℃、濕度40%～60%、光照12 h、自由進(jìn)食、進(jìn)水的環(huán)境中。

1.1.2 藥品與試劑：Trizol 試劑(Sigma 公司)；dNTP、 AMV、0. 22 μm硝酸纖維素膜(鄭州寶賽生物科技公司)；焦炭酸二已酯、瓊脂糖(INVITROGEN 公司)；Whaterman 3mm 濾紙、兔多克隆抗 iNOS 抗體(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(上海政祥化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷，二硫蘇糖醇(Solarbio公司)；甘氨酸、十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍(lán) R250、丙烯酰胺、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、Tween 20 TEMED(Sigma 公司)；DAB試劑盒(濃縮型)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱JC303A-T型(成都一恒科技有限公司)；生物組織包埋機(jī)BMJ-1(天津航空機(jī)電有限公司)；電熱恒溫水浴箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)；大鼠腦立體定位儀(美國(guó)STOELTING公司)；CUT5062型組織切片機(jī)(德國(guó)施利精密技術(shù)公司)；圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Image-Pro P1us)；PV-6000免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。 OLYMPUS IX71倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1. 2 方法

1.2.1 造模方法[4]：大鼠以10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔麻醉后，剪尾取50 μL自體新鮮不凝血，于前囟前0.22 mm、中線向左旁開3 mm處鉆孔，在立體定向儀引導(dǎo)下緩慢進(jìn)針注血。進(jìn)針深約5 mm(此為左側(cè)尾狀核位置)，進(jìn)針時(shí)間3 min，留針時(shí)間10 min，之后緩慢退針。實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠均可自由進(jìn)食水。假手術(shù)組除腦內(nèi)不注入血液外，其余操作同ICH模型組。模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)為術(shù)后見明顯肢體癱瘓，沿針道冠狀面切開腦組織可見血腫形成[5]。實(shí)驗(yàn)中2組各有4只大鼠死亡。造模成功率為90%。

1.2.2 觀察指標(biāo)：分別于術(shù)后第12、24、120 h對(duì)2組大鼠的神經(jīng)功能障礙程度進(jìn)行評(píng)價(jià)(采用Carica等制定的大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，最高18分、最低分3分，分?jǐn)?shù)越低表示神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重)；分別于造模后第3、6、10、12、24、48及120 h檢測(cè)2組大鼠腦組織中PN-1、凝血酶(thrombin)、蛋白酶激活受體-1(PAR-1)的變化情況。

1.2.3 HE染色：切片在二甲苯中脫蠟5～10 min。移入二甲苯和純酒精(1:1)混合液中5 min左右(如經(jīng)2次二甲苯脫蠟，此步可略)。加入100%、95%、85%、70%酒精，各級(jí)為2～5 min。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染液。蘇木精染液染色5～15 min。水洗玻片上多余染液，0.5%～1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制，直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止，約數(shù)10 s。流水沖洗15～30 min，或者在碳酸鋰飽和液中短時(shí)間堿化或藍(lán)化，即細(xì)胞核呈藍(lán)色。蒸餾水短洗。0.1%～0.5%伊紅染液染色1～5 min，若著色困難，可在每100 mL染液中加入1～2滴冰醋酸，使易著色且不易脫色。依次經(jīng)70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級(jí)為2～3 min，在95%以下濃度的酒精中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短時(shí)間。二甲苯透明(2次)，共約10 min。封片：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固

1.2.4 Western blot法：冰上分離出血腫周邊腦組織(假手術(shù)組為左側(cè)尾狀核)，置于預(yù)冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置1 h，4 ℃下14000 r/min離心30 min，去沉淀組織留上清液．考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定蛋白濃度，分裝。-70 ℃凍存。按總蛋白80 g計(jì)算上樣體積，4:1的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20 μL樣品緩沖液，于60 V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2 h，羊抗PN一抗體(1:200)、羊抗凝血酶抗體(1:500)、鼠抗PAR.1抗體(1:150)，2 h后加入二抗(兔多克隆抗iNOS 抗體，稀釋：1:10)。Image proplus 4．01版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能障礙評(píng)價(jià) ICH組大鼠的神經(jīng)功能障礙評(píng)分在造模后第12、48、120 h均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較分)Tab.1 Comparison of Neurological disorders scores between two groups rats at different time points(±s,scores)

*P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with sham operation

2.2 HE染色結(jié)果 倒置顯微鏡下可見假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮及溶解；ICH組大鼠在造模第12、48、120 h可見明顯的細(xì)胞排列紊亂、核溶解、固縮，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見部分腦組織出現(xiàn)液化壞死、呈空腔隙狀。見圖1。

圖1 假手術(shù)組和ICH組腦出血周圍組織病理變化(HE，×400)Fig.1 Sham group and ICH groups around the pathological changes of brain hemorrhage(HE，×400)

2.3 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1變化情況 2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織中PN-1、Thrombin和PAR蛋白表達(dá)見圖2。ICH組大鼠在造模后第3 h、6 h、10 h、12 h、24 h、48 h及120 h的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1表達(dá)量均較假手術(shù)組明顯增高(P<0.05)；ICH組大鼠的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1在造模后12 h出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)(P<0.05)。見表2、3、4。

圖2 PN-1、Thrombin和PAR蛋白表達(dá)的Western blot圖1：假手術(shù)組；2-8：分別為ICH組造模后第3、6、10、12、24、48及120 h Fig.2 PN-1, Thrombin and PAR protein expression by Western blot1:sham operation group; 2-8: corresponding to 3,6,10,12,24,48 and 120 h of ICH group after modeling

組別只數(shù)造模后3h造模后6h造模后10h造模后12h造模后24h造模后48h造模后120h假手術(shù)組360.45±0.050.46±0.100.47±0.080.51±0.130.42±0.090.41±0.050.40±0.07ICH組360.88±0.11△0.97±0.09Δ1.29±0.06△1.47±0.12△0.94±0.08△▲0.87±0.06△▲0.82±0.05△▲

△P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with sham operation group；▲P<0.05，與造模后第12h比較，compared with 12h after establishment of models

表3 2組間PN-1表達(dá)相對(duì)量比較

△P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with sham operation；▲P<0.05，與造模后第12h比較，compared with 12h after establishment of models

表4 2組間PAR-1表達(dá)相對(duì)量比較

△P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with sham operation；▲P<0.05，與造模后 12h 比較，compared with 12h after establishment of models

3 討論

腦出血患者經(jīng)內(nèi)科治療或者外科清除血腫后，部分會(huì)出現(xiàn)合并不同的神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，言語、聽寫以及運(yùn)動(dòng)功能損傷較為突出[6]。除了顱內(nèi)血管出血部位及出血程度的影響，對(duì)于腦出血患者腦組織周邊水腫程度的分析也利于揭示患者術(shù)后出現(xiàn)不同并發(fā)癥的原因，并有利于預(yù)后判斷。凝血酶為內(nèi)源性以及外源性凝血途徑的共同作用通路，凝血酶活性或者量的異常對(duì)于維持血管內(nèi)凝血機(jī)制具有重要意義。凝血酶的異常表達(dá)可能預(yù)示彌漫性血管內(nèi)凝血的凝血狀態(tài)、疾病轉(zhuǎn)歸以及病情程度，而其在腦出血中的研究較少。近年來部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在基底節(jié)腦出血周邊組織中存在凝血酶的異常激活和上調(diào)，其受體PAR-1表達(dá)也異常增高[7]。正常腦組織中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元包括大腦皮層扣帶回、皮質(zhì)、下丘腦核團(tuán)、丘腦腹側(cè)、中腦、海馬和小腦的神經(jīng)元，均存在一定程度的PAR-1的表達(dá)，但HE染色多數(shù)較弱，蛋白水平表達(dá)程度較低，而血管內(nèi)皮細(xì)胞中PAR-1的表達(dá)不清[8]。Thrombin抑制劑PN-1通過阻斷凝血酶與細(xì)胞膜表面的PAR-1的結(jié)合，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)三磷酸尿苷以及絡(luò)氨酸激酶的活性，下調(diào)在Xa因子(FXa)因子的作用下通過蛋白裂解的方式產(chǎn)生的凝血活酶，抑制凝血酶對(duì)于腦水腫組織的損傷作用[9]。本次研究重在探討凝血酶、凝血酶抑制劑以及凝血酶受體在大鼠腦出血模型中的表達(dá)差異。

2組大鼠造模后可見ICH組的神經(jīng)系統(tǒng)功能評(píng)分明顯降低，HE染色可以發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰完整，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，而ICH組大鼠腦細(xì)胞水腫以及壞死較為嚴(yán)重，細(xì)胞核崩解、碎裂，周邊神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可見部分腔隙樣以及液化性壞死，提示了本次造模的成功。本研究發(fā)現(xiàn)，PN-1、Thrombin、PAR-1在腦出血大鼠腦組織中異常表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，考慮腦出血對(duì)于腦組織的損傷不僅通過局部壓迫、血液凝固機(jī)化的損傷以及牽拉等作用，同時(shí)腦出血大鼠中凝血酶以及凝血酶作用受體的表達(dá)異常上升，促進(jìn)神經(jīng)纖維的細(xì)胞毒性損傷作用，而凝血酶抑制劑PN-1也繼發(fā)性顯著表達(dá)。時(shí)間特異度分析可見，在腦出血大鼠水腫吸收恢復(fù)期，凝血酶以及PAR-1、PN-1等呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，腦出血后12h內(nèi)，凝血酶對(duì)于出血腦血管通透性的改變促進(jìn)了PAR-1對(duì)于水腫部位腦組織的損傷，而造模后12h，由于腦水腫部分水通道的關(guān)閉，凝血酶以及PAR-1對(duì)于受損部位神經(jīng)纖維的水通道開放作用減弱，表達(dá)水平降低。凝血酶抑制劑PN-1通過特異性抑制凝血酶對(duì)于炎癥因子以及小膠質(zhì)細(xì)胞富集作用，進(jìn)而降低腦水腫程度[10]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)PN-1與腦組織的水腫程度或者病情的恢復(fù)具有顯著的相關(guān)關(guān)系，考慮PN-1作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在的特異性較高的凝血酶抑制劑，可以與凝血酶的非催化中心位點(diǎn)結(jié)合，形成十二烷基磺酸鹽復(fù)合物，與損傷的神經(jīng)纖維表面糖蛋白結(jié)合[11]，通過低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)或者細(xì)胞膜的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被降解或清除，減輕了凝血酶以及PAR-1對(duì)于腦水腫細(xì)胞的損傷[12]。

綜上所述，ICH實(shí)驗(yàn)證實(shí)大鼠水腫周圍腦組織中PN-1與Thrombin、PAR-1異常表達(dá)，其中Thrombin、PAR-1與腦水腫損傷有關(guān)，而PN--1可減輕凝血酶對(duì)于腦出血周邊神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，PN-1的這一作用揭示其可以作為腦出血患者內(nèi)科治療的新途徑，通過在腦出血急性期外源性注射PN-1細(xì)胞因子，進(jìn)而減輕腦出血水腫細(xì)胞損傷，改善臨床預(yù)后。

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(編校：王冬梅)

Expression and role of PN-1, thrombin and PAR-1 in rats brain edema tissue after intracerebral hemorrhage

TAN Yan-ping1Δ, ZHU Yong-kun2, YAO Hui3

(1. Department of Pharmacy, Foshan Chancheng Chaoyang Hospital, Foshan 528000, China; 2. Department of Pharmacy, Dongguan the Third People’s Hospital of Guangdong Province, Dongguan 523326, China; 3. Department of Pharmacy, Foshan People’s Hospital of Guangdong Province,Foshan 528000,China)

ObjectiveTo investigate expression and role of protease catenin-1(PN-1), thrombin(thrombin), protease activated receptor-1(PAR-1) in rats brain edema tissue after intracerebral hemorrhage(ICH).MethodsAdult male SD rats 80 were randomly divided into sham group,ICH group after number, 40 in each group, ICH group autologous arterial method of making a rat model of experimental ICH in the right caudate nucleus unit injection. The degree of neurological dysfunction between 2 groups was evaluated at 12 h,24 h and 120 h after post-operation. Observed the morphology of brain cells by HE staining. Changes of PN-1,thrombin, PAR-1 index in rat brain tissue at 3,6,10,12,24,48 and 120 h were detected by Western blot.ResultsNeurological dysfunction score ICH rats after modeling 12,48,120 h were significantly lower than the sham group(P<0.05); ICH in rats after modeling 3,6,10,12,24,48 and 120 h of brain tissue PN-1, thrombin, PAR-1 compared with sham-operated group were significantly increased(P<0.05); ICH rat brain tissue PN-1, thrombin, PAR-1 appeared in 12 h after modeling shwed a gradual downward trend(P<0.05).ConclusionICH hematoma surrounding brain tissue in rats PN-1 has the effect of inhibiting thrombin and PAR-1 overexpression, cause nerve damage.

intracerebral hemorrhage; rat; brain; thrombin inhibitors

廣東省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥強(qiáng)省課題(20121088)

譚燕萍，通信作者，女，碩士，副主任中藥師，研究方向：中藥藥學(xué)及臨床研究，E-mail：15212782883@qq.com。

R743.34

A

1005-1678(2015)11-0022-04