劉麗娟,范蕾,常福厚,白圖雅,呂小麗,李凌

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

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冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后的保護作用

劉麗娟,范蕾Δ,常福厚,白圖雅,呂小麗,李凌

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

目的 研究冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護作用。方法 50只Wistar大鼠隨機分成正常組、模型組、冠心十味丸低、高劑量組(0.3、0.9 mg/kg)、陽性對照組(復(fù)方丹參滴丸處理液)，每組各10只。構(gòu)建離體大鼠心臟再灌注實驗?zāi)Ｐ?，測定給藥后70 min各組大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量。結(jié)果 與模型組相比，冠心十味丸可明顯升高心肌缺血再灌注損傷時SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性(P<0.05或P<0.01)，降低缺血再灌注損傷時LDH、CK活性,減少MDA含量(P<0.05 或P<0.01)。結(jié)論 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血；再灌注損傷具有保護作用。

冠心十味丸；心肌缺血再灌注損傷；心肌酶

冠心十味丸是由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)自主開發(fā)的新藥，該藥由蒙醫(yī)古方而來，由十味中蒙藥材組成，按照君、臣、佐、使，科學(xué)組方設(shè)計而成，主要具有調(diào)心“赫依”、血相搏、活血、安心、化脂等功效，用于心煩、心區(qū)刺痛，心供血不足等。對于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可用來治療冠心病、高血脂、高血壓等疾病。本研究根據(jù)其功能主治，研究冠心十味丸對心肌缺血和心肌梗塞的保護作用，為其臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。本實驗擬采用離體大鼠心臟全心缺血再灌流法[1-2]，研究冠心十味丸對離體心臟全心缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性Wistar大鼠，180～220 g， 共50只。 清潔二級，來自內(nèi)蒙古大學(xué)動物室，合格證號 (京動字) 第 8806R011 號。

1.1.2 藥品與試劑：冠心十味丸(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，批號：130207048)，氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號：12122510)，25%烏拉坦(北京化工廠，批號：120125)，SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20130218)，LDH(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20130420)，CK(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20130211)，MDA(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20130303)，Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20130328，規(guī)格：100 T/96樣)，復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：120710)。

1.1.3 儀器：GL-2離體心臟灌流系統(tǒng)、YY-2藥液泵、HW-1000超級恒溫水浴(成都泰盟科技有限公司)，TG-16微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，旋片式真空泵(浙江飛躍機電有限公司)，TUBE MIXER TRIO數(shù)顯恒溫三用水箱(上海梅香儀器有限公司)，TG16-微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，YU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥：50只大鼠隨機分成正常組、模型組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組，各10只。正常組：平衡灌流70 min；模型組：平衡20 min，灌流10 min，停灌20 min，再灌20 min；冠心十味丸低劑量組和高劑量組：平衡20 min，含藥灌10 min，停灌20 min，再含藥灌20 min(低劑量給藥量：0.3 mg/kg，高劑量給藥量：0.9 mg/kg)；陽性對照組：平衡20 min，含復(fù)方丹參滴丸處理液灌流10 min，停灌20 min，再含藥灌20 min(給藥量：0.05 mg/kg)。

1.2.2 大鼠離體心臟全心缺血—再灌注(I/R)模型制備：術(shù)前皮下注射25%的烏拉坦0.4～0.6 mL/100g,麻醉后快速開胸，剪破心包膜，剪斷上下腔靜脈、肺動脈、主動脈(保留1 cm左右)及心臟周圍組織，取心臟置于冰的Kreb’s-Henseleit溶液中清洗除去污血，剔除血管、脂肪等非心肌組織，掛于GL-2離體心臟系統(tǒng)上進行灌流，灌流液采用氧飽和的37 ℃ K-H溶液。灌流結(jié)束后，用吸水紙吸取心臟水分，取左心室稱重，凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 組織勻漿制備與測定：從-80 ℃冰箱中取出左心室，解凍，用十字勻漿器冰水浴研磨，按心臟組織g重/生理鹽水mL數(shù)1:9將組織液制備成10%勻漿，然后低溫超速離心3500 r/min 離心10 min,取上清液，再用生理鹽水稀釋成1%的勻漿，嚴格按試劑盒說明書操作，考馬斯亮藍法測定心肌組織蛋白含量，測定心肌勻漿SOD、CK、LDH、MDA、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶；1%心肌組織勻漿的蛋白濃度為0.525 mg·prot/mL。

2 結(jié)果

2.1 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后SOD的影響 與正常組相比，模型組SOD酶活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比,冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后SOD值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注損傷時SOD酶活性。見表1。

表1 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后SOD的影響±s)Fig.1 Effect of GuanXinShiWeiWan on SOD activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后LDH的影響 與正常組相比，模型組LDH含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg,0.3 mg/kg)再灌注損傷后LDH值明顯降低(P<0.05)，即冠心十味丸可以降低心肌缺血再灌注損傷后LDH活性。見表2。

表2 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后LDH的影響±s)Fig.2 Effect of GuanXinShiWeiWan on LDH activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組對比較，compared with model group

2.3 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后MDA的影響 與正常組相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后MDA值明顯降低(P<0.01), 即冠心十味丸膠囊可以減少心肌缺血再灌注損傷后MDA含量。見表3。

表3 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后MDA的影響±s)Fig.3 Effect of GuanXinShiWeiWan on MDA content of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.4 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后CK的影響 與正常組相比，模型組CK活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后CK值明顯降低(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以降低心肌缺血再灌注損傷后CK活性。見表4。

表4 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后CK的影響±s)Fig.4 Effect of GuanXinShiWeiWan on CK activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.5 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Ca2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Ca2+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以升高心肌缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶活性。見表5。

表5 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.5 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.6 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Ca2+- Mg2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比,冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Ca2+-Mg2+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以升高心肌缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶活性。見表6。

表6 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.6 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-Mg2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.7 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Na+- K+-ATP酶活力顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注損傷后Na+-K+-ATP酶活性。見表7。

表7 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.7 Effect of GuanXinShiWeiWan on Na+- K+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 討論

目前認為,心肌缺血再灌注損傷的機制與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量產(chǎn)生、細胞內(nèi)鈣離子超載、血管內(nèi)皮細胞分泌一系列內(nèi)皮因子等因素有關(guān)[3-5]。實驗中，模型組離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性下降，CK、LDH活性升高，MDA含量升高。當(dāng)組織細胞缺血、缺氧時，氧自由基清除系統(tǒng)功能降低或喪失，而生成系統(tǒng)卻活性增強，一旦恢復(fù)組織血液供應(yīng)和氧供，氧自由基便大量產(chǎn)生與急劇堆積，以不同方式造成細胞急性或慢性損傷, SOD可清除氧自由基，使細胞免受氧自由基的毒性損傷[6]；丙二醛(MDA)是過氧化脂質(zhì)的一種重要分解產(chǎn)物，常被用作為脂質(zhì)過氧化程度的檢測指標，它可間接反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。而SOD作為內(nèi)源性的自由基清除劑，對過氧化脂質(zhì)的形成有阻止作用。缺血再灌注后產(chǎn)生的大量氧自由基及通過與不飽和脂肪酸作用引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的MDA，可通過多種途徑造成細胞膜及亞細胞器膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致再灌注損傷[7-9]。SOD是內(nèi)源性氧自由基清除劑，而MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，2者是能反映氧自由基的產(chǎn)生及引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的指標[10]。細胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)濃度的改變是造成MIRI的重要原因之一。當(dāng)心肌細胞缺血缺氧時，線粒體功能障礙導(dǎo)致ATP生成減少，再灌注后，細胞內(nèi)Ca2+增加，刺激線粒體鈣泵攝Ca2+，Ca2+與線粒體內(nèi)含磷酸根的化合物結(jié)合，形成沉淀，干擾線粒體的氧化磷酸化：Ca2+濃度升高可激活多種磷脂酶，促進膜磷脂分解，造成生物膜的損傷：由于Na+/Ca2+交換增加，形成一過性內(nèi)向性離子流，在心肌動作電位后形成遲后除極而引起心律失常；缺血再灌注后，細胞重新獲得能量，在胞漿中高濃度Ca2+的條件下，肌原纖維過度收縮，導(dǎo)致細胞凋亡 。由此可見，降低細胞內(nèi)Ca2+超載是再灌注損傷時心肌保護的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。

本實驗表明，冠心十味丸使SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量不同程度升高，可抑制乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的活性，并一定程度上減少了丙二醛(MDA)的生成，提示冠心十味丸可通過提高氧自由基清除劑的活力、增強心肌抗氧化能力、抑制心肌脂質(zhì)過氧化、減輕心肌缺血再灌注損傷時鈣超載而保護心肌達到預(yù)防MIRI的目的，并改善心肌缺血再灌注損傷后心臟功能。

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(編校：吳茜)

Protective effect of GuanXinShiWeiWan on isolated rat hearts with ischemia reperfusion injury

LIU Li-juan,FAN LeiΔ,CHANG Fu-hou,BAI Tu-ya,LV Xiao-li,LI Lin

(College of Phamacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of GuanXinShiWeiWan on ischemia reperfusion(I-R) injury rat.Methods50 Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, GuanXinShiWeiWan low (0.3 mg/kg)and high(0.9 mg/kg) dose group and positive group, each had 10 rats.Adopting the model of ischemia reperfusion injury of isolated rat hearts, the contents of SOD，MDA，LDH，CK and Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP，Na+- K+-ATP in cardiac muscle tissue were tested and compared.ResultsCompared with model group, GuanXinShiWeiWan significantly improved the activities of SOD、Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP and Na+- K+-ATP (P<0.05 orP<0.01) in cardiac muscle tissue which injured by ischemia reperfusion, while reducing markedly the contents of MDA，LDH，CK(P<0.05 orP<0.01).ConclusionGuanXinShiWeiWan can profect the cardiac muscle of ischemia reperfusion.

GuanXinShiWeiWan;myocardial ischemia reperfusion injury;cardiac enzyme

劉麗娟，女，碩士在讀，研究方向：微生物與生化藥學(xué)，E-mail：994097848@qq.com；范蕾，通訊作者，女，副教授，碩士，研究方向：中蒙藥藥理學(xué)研究，E-mail：826368267@qq.com。

R961.1

A

1005-1678(2015)03-0021-04