張建斌,李小慧

(1.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山西 長治 046011；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)康復(fù)科，山西 長治 046000)

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石榴汁對慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知行為的影響及其作用機(jī)制研究

張建斌1,李小慧2

(1.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山西 長治 046011；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院 神經(jīng)康復(fù)科，山西 長治 046000)

目的 探討石榴汁對慢性腦低灌注大鼠認(rèn)知行為的影響及其作用機(jī)制。方法 選取48只健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(sham operation，SO)、大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎 (permanent bilateral commancarotid artery occlusion or two-vessel occlusion, 2VO)組、石榴汁組。采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備慢性腦低灌注大鼠模型。術(shù)后1周開始給予干預(yù)，前2組用糖水灌胃(每100 mL糖水含蔗糖25 g，葡萄糖2 g，果糖2 g)，石榴汁組用石榴汁(多酚含量2.4～4.8 mg/mL)灌胃，均2 mL/d，共7周。術(shù)后第8周用Morris水迷宮檢測3組大鼠在學(xué)習(xí)方面的認(rèn)知行為能力，連續(xù)檢測5 d；間隔1 d后用空間探索試驗(yàn)的目標(biāo)象限游泳時(shí)間檢測3組大鼠記憶方面的認(rèn)知行為能力；用免疫組織化學(xué)方法檢測3組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHDG)、4-羥壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)的表達(dá)；觀察石榴汁是否能改善慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的作用，是否具有抗氧化應(yīng)激損傷作用。結(jié)果 在第4天和第5天，假手術(shù)組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間最短，2VO組時(shí)間最長,3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；3組大鼠在目標(biāo)象限出現(xiàn)時(shí)間假手術(shù)組最長(10.05±1.688) s，2VO組時(shí)間最短(6.343±1.220)s，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。3組大鼠皮質(zhì)與海馬CA1區(qū)4HNE、8-OHdG的陽性細(xì)胞的積分光密度值(integral optical density，IOD)以假手術(shù)組最低， 2VO組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。石榴汁干預(yù)后，大鼠的皮質(zhì)與海馬CA1區(qū)的8-OHdG、4-HNE的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 慢性腦低灌注可以引起氧化應(yīng)激性損傷，石榴汁可以改善慢性腦低灌大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，減少8-OHdG和4-HNE表達(dá)，可能通過抗氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮腦保護(hù)功能。

石榴汁；慢性腦低灌注；氧化應(yīng)激；認(rèn)知障礙

目前，隨著全球老齡化程度不斷加深，我國老年人數(shù)的急劇攀升，并在人民生活水平提高和生活方式改變的基礎(chǔ)上，腦血管病的危險(xiǎn)因素，如高血脂、高血粘度和糖尿病等，使得腦血管病的發(fā)病率及病死率居高不下，給國家和家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，引起各國學(xué)者的重視[1]。腦血管病是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)病率與致殘率最高的一種疾病，其中以慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)為主，約為62.4%，多見于老年人群[2]。重視對其進(jìn)行早期干預(yù)，防治認(rèn)知功能的發(fā)生和發(fā)展，具有積極意義。石榴(PunicagranatumL.)屬石榴科(Pumicaceae)石榴屬(Punica L.)植物，石榴汁提取物能夠有效地清除羥自由基和超氧陰離子自由基,抑制LDL和脂質(zhì)過氧化,抑制動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的形成,具有很強(qiáng)的抗氧化功能[3-5]。近年來，石榴廣泛用于預(yù)防和治療心血管疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，石榴汁總提取物比單個(gè)成分具有更強(qiáng)的生物活性，也說明石榴汁所具有的生物活性是十多個(gè)成分的化學(xué)協(xié)同作用[6]，本研究旨在探討石榴汁對慢性腦低灌注的大鼠認(rèn)知行為的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠40只，鼠齡8～10周，體質(zhì)量220～250 g， 購自北京大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(渝)20140015 ，本實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 藥品與試劑 石榴購自于陜西臨潼；4-羥基壬烯醛(4-HNE)兔多克隆抗體購自美國Alpha Diagnostic Intemational公司；辣根酶標(biāo)記山抗兔IgG購自美國Sigma公司；ECL Plus顯色試劑盒購自美國安瑪西亞公司；Folin—Ciocalteu試劑盒購自上海荔達(dá)生物科技有限公司；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物工程公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 Morris 水迷宮系統(tǒng)(美國Beckman公司)，電子天平(AE200型，瑞典梅特勒-托利多儀器有限公司)，凝膠圖像處理系統(tǒng)(日本OLMPUS公司)，PCR酶標(biāo)儀(深圳天南海北實(shí)業(yè)有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 石榴汁的制備：石榴洗凈去皮，帶無菌手套，經(jīng)無菌紗布壓汁，低溫離心，低溫真空濃縮器蒸發(fā)，冷卻，混合均勻分裝消毒管中，-20 ℃保存。

1.4.2 動(dòng)物分組及造模給藥：48只健康雄性Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字的方法將其隨機(jī)分為3組，假手術(shù)(sham operation，SO)組，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈持久性結(jié)扎 (permanent bilateral commancarotid artery occlusion or two-vessel occlusion, 2VO)組、石榴汁組。采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備慢性腦低灌注模型。術(shù)后1周開始給予干預(yù)，SO組和2VO組用糖水灌胃(每100 mL糖水含蔗糖25 g，葡萄糖2 g，果糖2 g)，石榴汁組用石榴汁(多酚含量2.4～4.8 mg/mL)灌胃，均2 mL/d，共7周。術(shù)后第8周用Morris水迷宮檢測3組大鼠在學(xué)習(xí)方面的認(rèn)知行為能力，連續(xù)檢測5 d；間隔1 d后用空間探索試驗(yàn)的目標(biāo)象限游泳時(shí)間檢測3組大鼠記憶方面的認(rèn)知行為能力;用免疫組織化學(xué)方法檢測3組大鼠皮層及海馬CA1區(qū)8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、4-羥壬烯醛(4-HNE)的表達(dá)；觀察石榴汁是否能改善慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力的作用，是否具有抗氧化應(yīng)激損傷作用。

1.4.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]：①定位航行試驗(yàn)測定逃避潛伏期，其實(shí)驗(yàn)步驟為：實(shí)驗(yàn)前1周將大鼠頭頸部染成黃色，水迷宮為一圓形水池，其大小水深等固定，且在池壁上等距離分別依次標(biāo)記四個(gè)方向: 東(E)、 南(S)、西(W)、北(N) ，在ES象限(第四象限) 正中離池壁30 cm處放一個(gè)圓形平臺(tái)，平臺(tái)直徑為10 cm，高30 cm水池上方安有攝像頭，圖像經(jīng)視頻輸入計(jì)算機(jī)，大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡被同步記錄。連續(xù)訓(xùn)練3 d，每天訓(xùn)練2次，每次隨機(jī)在NW、W、SW和E方向中選擇一個(gè)作為入水點(diǎn)，觀察并記錄大鼠爬上平臺(tái)的軌跡圖及所需時(shí)間(定位航行潛伏期) ，如果大鼠在120 s內(nèi)找不到平臺(tái)，則將大鼠引至平臺(tái)并在平臺(tái)上停留20 s，第4天去除平臺(tái)，選擇N 作為入水點(diǎn)觀察并記錄大鼠的游泳速度以及第四象限的游泳時(shí)間(空間探索時(shí)間) ，每只大鼠檢測1次。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.1.1 逃離潛伏期試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過兩因素方差分析(3×5)得出組和組之間的Morris水迷宮平均潛伏期時(shí)間有顯著性差異(F2，100=250.95，P<0.01)，各組的組內(nèi)經(jīng)過5 d訓(xùn)練，得到的Morris水迷宮平均潛伏期也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F4，100=56.03，P<0.01)；用LSD檢驗(yàn)，結(jié)果顯示在訓(xùn)練期的第4天和第5天，2VO組大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間顯著多于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而給予石榴汁干預(yù)組的大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間顯著少于2VO對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 石榴汁對慢性腦低灌注大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的比較*P<0.05，與2VO組相比；△P<0.05，與假手術(shù)組相比Fig.1 Comparison of pomegranate juice on learning and memory spacein rats with chronic cerebral hypoperfusion*P<0.05，compared with 2VO group；△P<0.05，compared with SO group

2.1.2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果：2VO 組大鼠在目標(biāo)象限出現(xiàn)的游泳時(shí)間為(6.343±1.220)s，顯著低于假手術(shù)組的時(shí)間(10.050±1.688)s，這2組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在用石榴汁灌胃干預(yù)后，可以明顯增加大鼠在目標(biāo)象限出現(xiàn)的游泳時(shí)間(8.950±2.371)s，而與2VO加用糖水灌胃處理的對照組時(shí)間為(6.343±1.220)s，這2組之間的比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠空間記憶認(rèn)知能力的比較±s)Tab.1 Comparison of spatial memory in rats of cognitive ability among three ±s)

*P<0.05，與2VO比較， compared with 2VO group；△P<0.05，與假手術(shù)組比較，compared with SO group

2.2 石榴汁對慢性腦低灌注大鼠8-OHdG 的影響

2.2.1 3組大鼠皮質(zhì)8-OHdG 的表達(dá)與統(tǒng)計(jì)分析：3組大鼠皮質(zhì)8-OHdG的IOD均值分別是假手術(shù)組(1788.82±183.01)、石榴汁組(4130.40±213.55)、2VO組(11515.34±921.73)。輸出結(jié)果顯示：經(jīng)石榴汁干預(yù)后，大鼠的皮質(zhì)8-OHdG 的表達(dá)明顯減少。經(jīng)方差分析LSD法得到結(jié)果：各組之間的8-OHdG 皮質(zhì)含量具有差異性(P<0.05)，且可以得出8-OHdG皮質(zhì)在大鼠皮質(zhì)的表達(dá)含量為：假手術(shù)組<石榴汁組<2VO組；說明石榴汁可以減少大鼠皮質(zhì)區(qū)8-OHdG的表達(dá)，可以降低慢性腦低灌注損大鼠的氧化應(yīng)激損傷，具有良好的抗氧化作用。見表2。

表2 3組大鼠皮質(zhì)8-OHdG方差分析Tab.2 Analysis of variance of 8-OHdG in cerebral cortex region among three groups

*The mean difference is significant at the 0 .05 level.

2.2.2 3組大鼠海馬CA1 區(qū)8-OHdG 的表達(dá)與統(tǒng)計(jì)分析:3組大鼠海馬CA1區(qū)8-OHdG的IOD均值分別是假手術(shù)組(655.67±151.28)、石榴汁組(1665.86±57.15)、2VO組(2776.47±188.10)。輸出結(jié)果顯示：經(jīng)石榴汁干預(yù)后，大鼠的海馬CA1區(qū)8-OHdG的表達(dá)明顯減少。經(jīng)方差分析LSD法得到結(jié)果：各組之間的8-OHdG海馬CA1區(qū)含量具有差異性(P<0.05)，且可以看出8-OHdG海馬CA1區(qū)的表達(dá)含量為：假手術(shù)組<石榴汁組<2VO 組；說明石榴汁可以減少海馬CA1區(qū)8-OHdG的表達(dá)，可以降低慢性腦低灌注損大鼠的氧化應(yīng)激損傷，具有良好的抗氧化作用。見表3。

表3 3組大鼠海馬CA1 區(qū)8-OHdG的方差分析Tab.3 Analysis of variance of 8-OHdG in hippocampus CA1 region among three groups

*The mean difference is significant at the 0 .05 level.

2.3 石榴汁對慢性腦低灌注大鼠4-HNE影響

2.3.1 3組大鼠皮質(zhì)4HNE 的表達(dá)與統(tǒng)計(jì)分析 3組大鼠皮質(zhì)的4-HNE IOD均值分別是：假手術(shù)組(1459.47±233.57)、石榴汁組(3150.87±173.64)、2VO 組(8695.24±326.58)。輸出結(jié)果顯示：經(jīng)石榴汁干預(yù)后，大鼠的皮質(zhì)4-HNE 的表達(dá)明顯減少。經(jīng)方差分析LSD法得到結(jié)果：P值均小于0.05，各組之間的4-HNE 皮質(zhì)含量具有差異性，且可以看出4-HNE皮質(zhì)的表達(dá)含量為假手術(shù)組<石榴汁組<2VO 組；說明石榴汁可以減少大鼠皮質(zhì)區(qū)4-HNE 的表達(dá)，可以降低慢性腦低灌注損大鼠的氧化應(yīng)激損傷，具有良好的抗氧化作用，見表4。

表4 3組大鼠皮質(zhì)的4-HNE 方差分析Tab.4 Analysis of variance of 4-HNE in cerebral cortex region among three groups

*The mean difference is significant at the 0.05 level.

2.3.2 3組大鼠海馬CA1 區(qū)4-HNE 的表達(dá)與統(tǒng)計(jì)分析 3組大鼠海馬CA1的4-HNE IOD均值分別是假手術(shù)組(442.22±62.98)、石榴汁組(1501.96±252.77)、2VO組(2546.31±430.74)。輸出結(jié)果顯示：經(jīng)石榴汁干預(yù)后，大鼠的大腦海馬CA1區(qū)4-HNE的表達(dá)明顯減少。經(jīng)方差分析LSD法得到結(jié)果：P值均小于0.05，各組之間的4-HNE 海馬CA1區(qū)含量具有差異性，且可以得出海馬CA1區(qū)的4-HNE表達(dá)數(shù)量為：假手術(shù)組<石榴汁組<2VO組；說明石榴汁可以減少海馬CA1區(qū)4-HNE 的表達(dá)，具有良好的抗氧化作用，見表5。

表5 3組大鼠海馬CA1 區(qū)4-HNE的結(jié)果分析Tab.5 Analysis of variance of 4-HNE in hippocampus CA1 region among three groups

*The mean difference is significant at the 0.05 level.

3 結(jié)論

慢性腦低灌注與氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激已被廣泛研究證實(shí)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷的重要致病原因之一[8]。機(jī)體內(nèi)大量的活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，可引起一系列氧化性生物效應(yīng)。

氧化中樞神經(jīng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)成份，產(chǎn)生氧化反應(yīng)，使神經(jīng)細(xì)胞 DNA 分子產(chǎn)生剪切，使蛋白質(zhì)氧化裂解，產(chǎn)生羰基衍生物及硝化酪氨酸等有毒性作用的物質(zhì)。另外，活性氧物質(zhì)還可使線粒體產(chǎn)生氧化性病理損傷[9-10]，使線粒體功能下降，體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)合成減少，導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞能量缺乏，產(chǎn)生病理性氧化損傷。中樞神經(jīng)細(xì)胞膜脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)及線粒體受氧化應(yīng)激損傷后產(chǎn)生的副產(chǎn)物，如過氧化物、乙醇、乙醛、甲酮和膽固醇氧化物等，都會(huì)對機(jī)體的正常細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的毒害作用[11]。有資料表明氧化應(yīng)激在腦血管低灌注過程中發(fā)揮重要致病作用。腦低灌注患者易感神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)易發(fā)生氧化性損傷，8-羥鳥苷酸常作為核酸的氧化損傷的標(biāo)志物[12]，目前多運(yùn)用于腦低灌注模型的氧化性應(yīng)激損傷的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)中模型組CA1 區(qū)8-OhdG的表達(dá)最高，與理論研究結(jié)果相一致，而石榴汁治療以后有所降低，證實(shí)石榴汁可以使大鼠的海馬CA1 區(qū)8-OHdG 的表達(dá)明顯減少，說明是石榴汁通過降低大腦氧化損傷而改變大腦低灌注。

有研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，氧化應(yīng)激條件下大量的氧自由基可使神經(jīng)元產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物——4-羥基壬烯醛(HNE)，后者可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，血管性癡呆模型大鼠的認(rèn)知能力下降。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組中海馬CA1 區(qū)4-HNE 的表達(dá)最高，而石榴汁治療海馬CA1 區(qū)4-HNE明顯減少，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明石榴汁通過減少氧化損傷而降低對大腦低灌注的影響。在本研究中，由于海馬CA1 區(qū)4-HNE和8-OhdG增加，而導(dǎo)致大鼠的認(rèn)知力下降。目前臨床多用抗氧化劑來抑制神經(jīng)細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善細(xì)胞功能，減輕氧化性腦損傷的目的。

綜上所述，石榴汁可以改善慢性腦低灌注大鼠的認(rèn)知行為功能，其機(jī)制可能是通過降低抗氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物——4-HNE和8-OhdG改變，而改善大腦低灌注。

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(編校：王冬梅)

Study of influence of chronic cerebral hypoperfusion on cognitive function and mechanisms in rats of pomegranate juice

ZHANG Jian-bin1,LI Xiao-hui2

(1.Department of Neurology, Heji Hospital, Affiliated Hospital of Changzhi Medical College,Changzhi 046011, China; 2.Department of Neurological Rehabilitation, Heji Hospital, Affiliated Hospital of Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

ObjectiveTo explore the influence of pomegranate juice on cognitive behavior of chroniccerebral hypoperfusion in rats and its mechanism.Methods48 healthy male Wistar rats were selected and randomly divided into 3 groups, sham operation group (SO), permanent bilateral persistence commancarotid artery occlusion or two-vesselocclusion (2VO) group, pomegranate juice group. Chronic cerebral hypoperfusion model was prepared in rats by permanent bilateral common carotid artery ligation. Given the intervention after operation 1 weeks, before the 2 groups were given by sugar water intragastric (every 100 mL syrup containing 25 g,sucrose 2 g, fructose glucose 2 g) with pomegranate juice, pomegranate juice group (polyphenol content of 2.4-4.8 mg/mL) were given by gavage,2 mL/d, a total of 7 weeks. 8 th weeks after surgery, cognitive behavior ability of 3 groups was tested by space exploration target quadrant swimming time after an interval of 1day ; CA1 region of 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG), 4- hydroxyl nonenal (4-HNE)expression of 3 groups in cortex and hippocampus detected by immunohistochemical method; observed whether it could improve the chronic cerebral hypoperfusion in rats learning, memory ability, or had antioxidative stress injury. ResultsOn the 4th day and 5th day, the time of rats in SO to find the platform and the shortest time, group 2VO for the longest time, compared with statistical significance between the three groups (P<0.01); the 3 groups of rats in the target quadrant emergence time in sham operation group, the longest (10.05+1.688)s, 2VO group has the shortest time (6.343±1.220) s, and there was statistical significance (P<0.05). The integral optical density of positive cells in 3 groups of rats cortex and hippocampal CA1 region of 4HNE, the value of the 8-OHdG IOD is the lowest in the sham operation group, 2VO group was the highest, with statistical significance. Pomegranate juice intervention, cortex of rats and hippocampal CA1 region of 8-OHdG, 4-HNE decreased significantly(P<0.05).ConclusionChronic cerebral hypoperfusion may cause oxidative stress injury, pomegranate juice can improve the low irrigation learning and memory ability of rats with chronic cerebral, decrease 8-OHdG and 4-HNE expression may play a protective function through antioxidative stress pathway.

pomegranate juice; chronic cerebral hypoperiusion;oxidative stress; cognitive impairment

山西省高?？萍柬?xiàng)目(200713024)

張建斌，男，碩士，副教授，研究方向：腦血管病的診斷和治療，E-mail：zhangjb0122@sina.com。

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1005-1678(2015)03-0058-04