楊陽,朱梅Δ,劉政,章曉鋒,嚴(yán)飛,趙溪巖

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲科/云南省超聲影像研究中心，云南 昆明 650032；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 超聲科，重慶 400037； 3.中國科學(xué)院 深圳先進(jìn)技術(shù)院，廣東 深圳 518055；4.海南醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199)

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載VEGFR-3抗體淋巴管靶向微泡的體外尋靶試驗(yàn)研究

楊陽1,朱梅1Δ,劉政2,章曉鋒1,嚴(yán)飛3,趙溪巖4

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲科/云南省超聲影像研究中心，云南 昆明 650032；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院 超聲科，重慶 400037； 3.中國科學(xué)院 深圳先進(jìn)技術(shù)院，廣東 深圳 518055；4.海南醫(yī)學(xué)院 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199)

目的 制備載VEGFR-3抗體的淋巴管靶向微泡，觀察體外尋靶效果。方法 采用生物素-親和素橋接法制備載VEGFR-3抗體靶向微泡，進(jìn)行體外尋靶實(shí)驗(yàn)，采用分組對照實(shí)驗(yàn)以直接、間接法觀察尋靶效果。直接法使用圖像分析軟件IPP進(jìn)行離線分析及采用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；間接法采用分組孵育、離心法直觀觀察靶向結(jié)合效果。結(jié)果 圖像軟件IPP離線分析結(jié)果顯示靶向組微泡與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合數(shù)量明顯多于普通組；高倍顯微鏡下(×100倍)靶向組平均每個視野有(151±20)個靶向微泡粘附，普通組平均每個視野有(12±4)個普通微泡粘附，靶向組與普通組微泡結(jié)合數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.19，P<0.01)。間接觀察法結(jié)果顯示：與普通組相比，靶向組中靶向微泡與細(xì)胞能逐步牢固的結(jié)合。結(jié)論 制備的載VEGFR-3抗體淋巴管靶向微泡體外尋靶效果明顯優(yōu)于普通微泡。

VEGFR-3抗體；微泡；尋靶；體外實(shí)驗(yàn)

目前，靶向超聲造影已成為一種能靶向顯影特定區(qū)域腫瘤的影像學(xué)方法[1-2]。相比普通的超聲造影劑，攜載配體的靶向超聲造影劑能以抗原抗體的方式，靶向到特定的腫瘤區(qū)域，大量的聚集、長時間的停留在靶區(qū)，以此可獲得良好的超聲增強(qiáng)顯影效果[3-4]。

研究表明在腫瘤組織中，腫瘤周邊新生淋巴管、擴(kuò)張的淋巴管、有癌栓的淋巴管和有腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR-3呈高表達(dá)[5]?；诖?，設(shè)想在培養(yǎng)皿中接種腫瘤新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，以VEGFR-3作為靶點(diǎn)，制備載VEGFR-3抗體的靶向微泡，進(jìn)行分組對照實(shí)驗(yàn)，以直接、間接法觀察尋靶效果，并做相關(guān)圖像分析，以期為下一步在體內(nèi)淋巴管顯影提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器

雄性Wistar大鼠，5～7周齡，體質(zhì)量200g左右，購自北京維通利華，動物合格證號：，SCXK(京)2014-0004。

自制生物素化脂質(zhì)微泡(第三軍醫(yī)大學(xué))，生物素化VEGFE-3抗體(eBioscience，美國)，親和素、細(xì)胞膜染料DII(Sigma，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，美國)。

倒置顯微鏡(Leica-DMI3000B，德國)，臺式高速冷凍離心機(jī)(RHERMO-STRATOS，德國)，微泡機(jī)械震蕩儀(威爾德-DZ2014，深圳)。

1.2 方法

1.2.1 生物素化脂質(zhì)微泡的制備：把一定量的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(MPEG200)，二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)，聚乙二醇(PEG400)，生物素化脂質(zhì)(DSPE-PEG2000-Biotin)等按一定比例充分混懸后分裝于3 mL的西林瓶中，按設(shè)定好的凍干工藝程序進(jìn)行冷凍干燥，制備脂質(zhì)凍干粉，并以全氟丙烷置換其中的空氣，加入溶酶液，按特定程序機(jī)械振蕩儀充分混懸，制備生物素化微泡。

1.2.2 生物素-親和素橋接法制備靶向微泡：取制備好的生物素化微泡用PBS稀釋至1×107/mL，取500 μL加入親和素50 μg，充分混合，室溫孵育30 min，400 g條件下離心3 min，棄下清液，加入等量PBS，重復(fù)3次，以1:100的比例加入生物素化的VEGFE-3抗體室溫孵育30 min，400 g條件下離心3 min，棄下清液，加入等量PBS，重復(fù)3次，得到載VEGFR-3抗體的靶向微泡。

1.2.3 小鼠胸導(dǎo)管淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：采用胸導(dǎo)管內(nèi)灌注酶消化分離法。取雄性Wistar大鼠，體視顯微鏡下小心分離胸導(dǎo)管，灌注胰酶消化。收集到的溶液1500 r/min離心3 min，將分離的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過檢測因子Ⅷ相關(guān)抗原對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，將第三代細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24 h貼壁后待用。

1.2.4 靶向微泡與普通微泡分組體外尋靶對照實(shí)驗(yàn)：選取6個細(xì)胞生長情況相近的培養(yǎng)皿，隨機(jī)平均分為靶向組與普通組，分別取0.5 mL，濃度為1×109個/mL的靶向微泡與普通微泡分別緩慢注入培養(yǎng)皿中，輕微震蕩，使微泡均勻混合于培養(yǎng)液中，靜置5 min，以PBS沖洗3次，至顯微鏡下(×100倍)進(jìn)行觀察，使用圖像分析軟件(Image pro plus，IPP)進(jìn)行離線圖像分析；2組分別選取20個不同視野,對與細(xì)胞結(jié)合的微泡進(jìn)行計數(shù), 每個視野重復(fù)測量3次，每次測量由不同人員進(jìn)行。

1.2.5 DII染色細(xì)胞混懸液的制備：選取細(xì)胞生長狀態(tài)較好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，胰酶消化貼壁細(xì)胞，使之游離，加入完全培養(yǎng)基終止消化，移入15 mL離心管中，1500 r/min 離心3 min，棄上清液備用；稱取10 μg DII染料溶于1 mL無水乙醇中，待充分溶解后加入離心管中，與細(xì)胞混勻，待細(xì)胞著色后，1500 r/min 離心3 min，棄上層液體，PBS涮洗3次，加入完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至0.2×109/mL。

1.2.6 靶向微泡與普通微泡結(jié)合間接對照尋靶實(shí)驗(yàn)：以染色細(xì)胞與微泡1:20的比例，將0.5 mL，1×109/mL細(xì)胞混懸液分別加入到2支15 mL離心管中，隨機(jī)標(biāo)記為靶向組與普通組，分別向兩支離心管中緩慢加入2 mL，1×109/mL靶向微泡與普通微泡，輕微振蕩孵育10 min，1500 r/min 離心3 min，肉眼觀察結(jié)合效果。

2 結(jié)果

2.1 微鏡下和圖像分析軟件對2組微泡的分析結(jié)果 顯微鏡下觀察，靶向組大量微泡粘附于細(xì)胞上，PBS沖洗后，僅游離微泡被洗掉，粘附于細(xì)胞的靶向微泡基本無變化；普通組微泡在PBS沖洗后幾乎消失于整個視野中。使用圖像分析軟件IPP離線分析后，軟件自動標(biāo)記的微泡(紅色)，靶向組與結(jié)合的微泡數(shù)量遠(yuǎn)高于普通組。見圖1。

圖1 顯微鏡下和圖像分析軟件IPP離線分析圖像(×100)Fig.1 Off-line analysis by image analysis software IPP under microscope(×100)

顯微鏡下靶向組平均每個視野有(151±20)個靶向微泡粘附，普通組平均每個視野有(12±4)個普通微泡粘附，靶向組與普通組微泡結(jié)合數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.186，P<0.01)，見圖2。

圖2 靶向組、普通組與細(xì)胞結(jié)合的微泡數(shù)量比較Fig.2 Comparison of combining microbubbles between targeted-group and ordinar-group

2.3 間接法觀察靶向組、普通組與染色細(xì)胞結(jié)合結(jié)果 間接觀察法中，起初2組并無明顯差異，見圖3A。振蕩孵育3 min后，靶向組中白色靶向微泡與紫紅色細(xì)胞2者顏色開始混合，染色細(xì)胞開始出現(xiàn)在白色微泡層中；而普通組中并無顏色混合，少量紫紅色細(xì)胞開始沉淀于離心管底部，見圖3B。振蕩孵育10 min后，靶向組紫紅色細(xì)胞幾乎全位于白色微泡層；普通組紫紅色細(xì)胞更多的沉淀于管底，見圖3C。離心后，靶向組紫紅色細(xì)胞位于白色微泡層，管底幾乎不見染色細(xì)胞；普通組白色微泡層不見紫紅色，管底可見與實(shí)驗(yàn)開始時等量的染色細(xì)胞沉淀見圖3D。間接證明靶向組中靶向微泡與細(xì)胞能逐步牢固的結(jié)合，并在1500 r/min，離心3 min條件下仍能保證穩(wěn)固的結(jié)合效果，而普通組中細(xì)胞在上述離心力下，幾乎全部沉于管底。

圖3 間接法觀察靶向組、普通組與染色細(xì)胞結(jié)合效果比較A.染色細(xì)胞混懸液；B.分別向兩組加入靶向、普通微泡；C.振蕩孵育10 min后效果；D.1500 r/m，離心3 min后效果Fig.3 Comparison of combination with unstained cells between targeted-group and ordinar-group by Indirect methodA.suspension of unstained cells;B.targeted and ordinar-microbubbles added respectively to the two groups;C.effect after mechanical oscillation incubate 10 min;D.result after centrifuge 1500 r/min,3 min

3 討論

傳統(tǒng)的超聲造影，主要依靠觀察動脈像、靜脈像特征性的時間——強(qiáng)度關(guān)系，記錄開始增強(qiáng)時間、達(dá)峰時間、消退時間及增強(qiáng)區(qū)域的先后順序來鑒別腫瘤的良惡性質(zhì)，這在一定程度上會受主觀因素的影響，各學(xué)者對此的研究結(jié)果也各不相同，且差異多無統(tǒng)計學(xué)意義[6-9]。目前，相比傳統(tǒng)的超聲造影劑，在微泡表面標(biāo)記腫瘤相關(guān)特異性抗體的靶向超聲造影劑，通過抗原抗體結(jié)合方式，使微泡大量特異性的與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，讓特定區(qū)域持續(xù)、顯著的增強(qiáng)，在很大程度上能客觀的證明該區(qū)域?yàn)槟[瘤所在[10-12]。

在國內(nèi)外相關(guān)研究中，靶向微泡的制作、與細(xì)胞特異性結(jié)合的研究均有報道，但總體靶向粘附率不高，容易脫靶，因此靶向效果不盡如人意[13-15]。本課題組經(jīng)過長期研究，不斷改進(jìn)、篩選制備方法，優(yōu)化流程，調(diào)整試劑配比，成功制備出粒徑均一、長效穩(wěn)定，抗體粘附率高的載VEGFE-3抗體靶向微泡。本次體外實(shí)驗(yàn)以直接、間接方式觀察尋靶效果，并用圖像分析軟件及SPSS軟件進(jìn)行客觀評價。尤其在間接觀察法中，課題組利用微泡質(zhì)量輕，細(xì)胞質(zhì)量大的特性，將2者加入離心管，充分孵育，靶向組微泡能與細(xì)胞結(jié)合，離心后細(xì)胞仍位于微泡層；普通組同等條件處理后，因普通微泡不會與細(xì)胞結(jié)合，細(xì)胞明顯與微泡分層，在離心力作用下沉淀于管底。最終，通過軟件分析，直接、間接的證實(shí)了載VEGFE-3抗體靶向微泡體外尋靶效果明顯優(yōu)于普通微泡。

此靶向造影劑的成功制備及較好的體外尋靶效果為下一步在體內(nèi)腫瘤新生淋巴管靶向顯影提供了重要依據(jù)。不僅有望使造影劑大量聚集在淋巴管靶區(qū)，增加對比顯像效果，更能使造影劑長時間粘附于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，相比造影劑短時間消退區(qū)域更容易被識別，也使淋巴管靶向微泡成為客觀診斷淋巴系統(tǒng)腫瘤的有效方法。總之，靶向微泡有望作為一種特異性識別淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的分子探針，在超聲介導(dǎo)下，準(zhǔn)確的顯示腫瘤新生淋巴管，并對腫瘤良惡性質(zhì)做出鑒別。

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(編校：吳茜)

Targeting study of VEGFR-3 antibody loaded microbubble in vitro

YANG Yang1,ZHU Mei1Δ,LIU Zheng2,ZHANG Xiao-feng1,YAN Fei3,ZHAO Xi-yan4

(1.Department of Ultrasound, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China; 2.Department of Ultrasound, Xinqiao Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 3.Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen 518055, China; 4.Laboratory of Human Function, Hainan Medical University, Haikou 571199, China)

ObjectiveTo prepare targeted microbubbles which load anti-VEGFR-3 and observe the targeting effect in vitro.MethodsTargeted microbubbles loaded VEGFR-3 antibody were prepared and the targeting effect in vitro were tested by direct and indirect methods.Direct method took off-line analysis by image analysis software IPP and statistical analysed with SPSS software package.Indirect method took direct observation the target binding effect after incubation and centrifugal sedimentation.Results Image software IPP results showed that the quantity of microbubbles in targeted-group was obviously more than ordinary group.The average microbubbles per field in targeted-group was (151±20).The average microbubbles per field in ordinary group was (12±4) microbubbles, the numbers of combined microbubbles between targeted-group and ordinary-group had significant differences(t=19.19，P<0.01).The indirect method results showed that, compared with ordinary group, the microbubbles in targeted-group could combined with cell gradually.ConclusionTargeted microbubbles load anti-VEGFR-3 have a better contrast effect than common microbubbles.

VEGFR-3 antibody; microbubbles;target;in vitro

國家自然科學(xué)基金 (81160178)

楊陽，男，碩士在讀，研究方向：超聲基礎(chǔ)研究，E-mail:yangyzyyx@163.com；朱梅，通訊作者，女，碩士、副主任醫(yī)師，研究方向：靶向聲學(xué)造影和非創(chuàng)傷性超聲治療，E-mail：zhumeics@163.com。

R318

A

1005-1678(2015)03-0010-03