潘婷,朱亮

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

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中藥菊花煎劑對小兒RSV感染A549細(xì)胞后趨化因子影響的研究

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215000)

目的 分析中藥菊花煎劑對小兒呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus ，RSV)感染氣道上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞)后趨化因子的影響。方法 以近期蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的住院小兒確診RSV型肺炎患者64例作為研究對象，分析患兒感染RSV后的臨床病癥。建立RSV感染A549細(xì)胞模型，對感染后細(xì)胞進行細(xì)胞培養(yǎng)，加入中藥菊花煎劑和常規(guī)抗病毒藥觀察其對RSV感染細(xì)胞的存活率影響；用ELISA試劑盒測定并比較2組細(xì)胞液中趨化因子MCP-1及RANTEs的表達情況。結(jié)果 體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，中藥菊花煎劑有直接的抑制病毒生長復(fù)制的作用，且存在一定的正量效應(yīng)；RSV感染A549細(xì)胞后，MCP-1和RANTEs表達或釋放明顯增多(P<0.05)，中藥菊花煎劑及抗病毒藥干預(yù)后，其表達明顯降低(P<0.05)，但是其總量仍顯著高于正常值。結(jié)論 中藥菊花煎劑能在一定程度上抑制RSV感染A549細(xì)胞釋放趨化因子RANTEs和MCP-1，從而起到減輕患兒氣道炎癥反應(yīng)的作用。

中藥菊花煎劑；小兒肺炎；呼吸道合胞病毒；A549細(xì)胞；趨化因子

肺炎是威脅小兒身心健康的一類重要疾病， 又以病毒性肺炎為甚。在發(fā)展中國家，病毒性肺炎是兒童發(fā)病率最高的疾病占小兒住院疾病之首，也是6歲以下兒童死亡的重要因素[1]。小兒肺炎若未得到及時的診治，極易發(fā)生其他并發(fā)癥，如肺氣腫、肺不張等，給后續(xù)治療及預(yù)后帶來很大的影響[2]。此外，某些病原體所致肺炎與小兒支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)，如呼吸道合胞病毒肺炎和支原體性肺炎[3]。目前，臨床上針對小兒肺炎多采用西醫(yī)抗病毒及對癥治療，而抗生素類藥物對小兒生長發(fā)育的副作用卻不容忽視。中醫(yī)中藥在治療病毒性肺炎上有其獨特的優(yōu)勢，研究表明其不僅能抑制病毒生長還具有副作用小，調(diào)節(jié)兒童免疫能力等優(yōu)點。但其具體作用機制仍未明確[4-5]。為此，本研究將利用蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病例資源，探討分析中藥菊花煎劑對防治RSV感染性肺炎的免疫機制尤其是對氣道炎癥的影響，為中醫(yī)治療病毒性肺炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 體外實驗所用氣道上皮細(xì)胞株(A549細(xì)胞)購于中山大學(xué)動物實驗中心；細(xì)胞培養(yǎng)液成分均為本實驗室自配(MEM中加入10%牛胎血清，濃度為100pg/mL的青霉素溶液及濃度為100pg/mL的鏈霉素溶液[6])；呼吸道合胞病毒(RSV)由本研究所病毒室提供。

1.2 儀器與試劑 二甲基亞楓(DMSO)和用于測定炎癥因子RANTES、MCP-1、MIP-1α表達及釋放量的相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)基為含10%牛胎血清的MEM，分別加入青霉素和鏈霉素至100 pg/mL。加入A549細(xì)胞至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，然后將培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)，每隔2～3 d進行1次培養(yǎng)液更換，同時進行顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及聚集情況，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時停止培養(yǎng)，取出進行實驗。

1.3.2 A549細(xì)胞存活率的測定：采用MTT法測定感染RSV的A549細(xì)胞的存活率。分別測定藥物濃度為2、4、8、16、32、64和128 μg/L的細(xì)胞存活率。將細(xì)胞培養(yǎng)液上清液棄去，于培養(yǎng)板中加入濃度為5 mg/mL的MTT液50 pL/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h后，棄MTT上清，用PBS液洗3次，每孔加溶解液200 μL，手動均勻進行5～10 min的震蕩，觀察結(jié)晶情況，待其完全溶解后放置于酶標(biāo)測定儀上，分別測定中藥菊花煎劑組、病毒唑組和細(xì)胞對照組細(xì)胞于570 nm波長處的光密度OD值，并根據(jù)細(xì)胞存活率[7-8]=藥物組平均OD570/細(xì)胞對照組平均OD570×100%，計算各組細(xì)胞存活率。

1.3.3 中藥菊花煎劑對感染RSV的A549細(xì)胞趨化因子的測定：將培養(yǎng)成層的A549細(xì)胞消化成單層細(xì)胞，并以0.1 mL/孔加入96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板中。接種RSV病毒后，加入含藥維持液，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進行實驗。采用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)分別測定上清液中MCP-1和RANTEs的含量。

2 結(jié)果

2.1 我院近期患兒肺炎病原體感染情況 選取我院近期兒童肺炎患者共679例，進行病原體培養(yǎng)定型，結(jié)果表明，感染率最高的為肺炎支原體，共247例，占36.45%。本研究中選取感染率為9.40%的RSV感染患兒共64例，見表1。

表1 我院近期患兒肺炎病原體感染分布情況Tab. 1 The pathogen distribution in children with pneumonia recently in our hospital

2.2 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用 RSV感染氣道上皮細(xì)胞A549后表現(xiàn)為：細(xì)胞腫脹、變形、壁增厚及折光性減弱，并且可見到明顯的細(xì)胞融合現(xiàn)象，形成合胞體。測定細(xì)胞存活率結(jié)果表明：藥物濃度增加，細(xì)胞存活率下降，即病毒抑制率增高。見表1。

表1 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用Tab.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

圖1 中藥菊花煎劑對RSV的抑制作用Fig.1 Inhibition of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV

2.3 中藥菊花煎劑對RSV感染A549后誘導(dǎo)RANTES釋放作用的影響 中藥菊花煎劑組RANTES的表達顯著低于其他2組(P<0.05)，見表2。

表2 中藥菊花對RSV感染A549細(xì)胞后誘導(dǎo)RANTES釋放作用影響Tab.2 Influence of RANTES release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，與細(xì)胞對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與病毒唑組比較，compared with virazole group

2.4 中藥菊花煎劑對RSV感染A549后誘導(dǎo)MCP-1釋放作用的影響 中藥菊花煎劑組MCP-1的表達顯著低于其他2組(P<0.05)，見表3。

表3 中藥菊花對RSV感染A549細(xì)胞后誘導(dǎo)MCP-1釋放作用影響Tab.3 Influence of MCP-1 release by Chinese medicine chrysanthemum of RSV infecting A549 cells

*P<0.05，與細(xì)胞對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與病毒唑組比較，compared with virazole group

3 討論

肺部炎癥目前已被世界衛(wèi)生組織列為全球最常見3種兒科疾病之一[9]。就我國情況來看，小兒肺炎發(fā)病率較高，且呈日益增長趨勢。若未經(jīng)過及時的診治，小兒肺炎將發(fā)生各種并發(fā)癥，甚至哮喘等其他嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病[10]。西醫(yī)治療小兒肺炎常用的為病毒唑等抗病毒藥，此類藥效果顯著，但是對小兒生長發(fā)育有著極大的影響和副作用[11]。本文利用本院資源，研究中藥菊花煎劑對RSV感染A549細(xì)胞趨化因子的影響。

體外實驗結(jié)果顯示，中藥菊花煎劑對RSV感染后的A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，當(dāng)藥物濃度達到128μg/L時感染細(xì)胞的存活率即以降為41.9%，與細(xì)胞對照組的96.2%相比， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

RANTEs是一種由T細(xì)胞表達和分泌的正常趨化因子，可作用于單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，但中性粒細(xì)胞不受RANTEs趨化作用[13-14]。此外，RANTEs還能促進自然殺傷細(xì)胞遷移和激活記憶T細(xì)胞、單核細(xì)胞。MCP-1與RANTEs屬于同一家族。研究已表明，RSV感染能促進RANTEs和MCP-1的表達和釋放[15]。Babara[16]研究顯示，體外實驗中感染RSV的A549細(xì)胞中趨化因子RANTEs、MCP-1和MCP-1α的mRNA和蛋白表達及釋放量均增加，并且與RSV感染的劑量和持續(xù)時間成正相關(guān)。

本實驗研究結(jié)果提示正常人體的氣道上皮細(xì)胞即可表達和釋放一定量的RANTES和MCP-l等趨化因子。當(dāng)RSV感染人體A549細(xì)胞后會顯著增加趨化因子RANTES和MCP-l的表達量或釋放量，這與其他文獻[17-18]發(fā)表的研究結(jié)果相吻合，表明RSV感染性性肺炎可能通過刺激人體氣道上皮細(xì)胞釋放趨化因子RANTES、MCP-1，從而誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞，如單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在患者氣道黏膜的趨化與聚集，進而造成被感染者持續(xù)而嚴(yán)重的氣道炎癥反應(yīng)[19]。本實驗結(jié)果還表明通過中藥菊花煎劑干預(yù)，感染RSV患者體內(nèi)RANTES、MCP-1的表達與釋放明顯降低，但較正常細(xì)胞組而言，仍顯著增加，提示臨床上中藥菊花煎劑治療RSV感染性小兒肺炎的機理不僅在于藥物抗病毒作用，更取決于其能在一定程度上抑制氣道上皮細(xì)胞表達和釋放RANTES、MCP-1等趨化因子，從而達到減輕氣道炎癥高反應(yīng)性的作用。

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(編校：王冬梅)

Effects of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on Pediatric RSV infection after A549 cell chemotactic factor

PAN Yue-ting,ZHU Liang

(Department of Pharmacy, The Second Hospital Affiliated To Suzhou University, Suzhou 215000, China)

ObjectiveTo study effect of traditional Chinese medicine chrysanthemum decoction on RSV infection after A549 cells chemotactic factor.MethodsSubjects from The Second Hospital Affilated To Suzhou University in recent days, 64 cases of patients diagnosed with RSV effected pneumonia by clinical examination, RSV infection A549 cell model was established and the infected cells were cultured, chrysanthemums with TCM decoction and conventional antiviral observed its effect on RSV infection cell survival, compared two groups of cell SAP was determined by ELISA kit and the expression of RANTEs and chemokines MCP-1.ResultsChrysanthemum, according to the results of in vitro cell culture studies traditional Chinese medicine decoction had the effect of directly inhibit the growth of virus replication, and there were some positive effects RSV infected A549 cells, MCP-1 and RANTEs expression or release significantly increased (P<0.05). Chrysanthemum Chinese medicine decoction and antiviral drugs after the intervention, the expression of MCP-1 and RANTES reduced significantly (P<0.05), but overall volume was still significantly higher than the normal.ConclusionChrysanthemum Chinese medicine decoction can inhibit RSV infected A549 cells release chemokine RANTEs and MCP-1 to some extent, and then reduce the airway inflammation reaction of children.

chrysanthemum Chinese medicine decoction;pediatric pneumonia;respiratory syncytial virus(RSV);chemokines

潘玥婷，女，大專，藥師，研究方向：藥劑學(xué)，E-mail:zzy9904@163.com。

R245.81

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1005-1678(2015)03-0082-03