張?jiān)来?，施琳琳，顧麗澤，蘇旭江，呂振雷，凌衛(wèi)明Δ

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫同仁國際康復(fù)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 無錫 214151； 2.天津市第三中心醫(yī)院 營養(yǎng)科，天津 300170；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心 精神科，江蘇 無錫 214151)

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高效液相色譜法測定人頭發(fā)中喹硫平濃度

張?jiān)来?，施琳琳2，顧麗澤1，蘇旭江3，呂振雷3，凌衛(wèi)明1Δ

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫同仁國際康復(fù)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 無錫 214151； 2.天津市第三中心醫(yī)院 營養(yǎng)科，天津 300170；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心 精神科，江蘇 無錫 214151)

目的 建立一種高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，用來測定人頭發(fā)中的喹硫平濃度。方法 色譜柱使用Inertsil ODS-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為0.01 mol/L醋酸銨-甲醇(32︰68)，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長為254 nm，以正已烷為萃取劑，建立HPLC法。結(jié)果 喹硫平在5～200 ng/mg范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系，萃取回收率>75.0%，方法回收率在 95.0%～105.0%之間，日內(nèi)和日間精密度均<10.0%，符合生物樣品分析要求。結(jié)論 本研究建立了測定人頭發(fā)中喹硫平濃度的HPLC法，該方法操作簡單，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

頭發(fā)；喹硫平；高效液相色譜

精神分裂癥是臨床上最常見的慢性精神疾病，其復(fù)發(fā)、致殘率高，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。喹硫平是一種新型非典型抗精神病藥，主要作用于5-羥色胺及多巴胺(D1、D2、D4)受體，常用于治療各型精神分裂癥，也可減輕與精神分裂癥有關(guān)的情感癥狀如抑郁、焦慮及認(rèn)知缺陷等，同時(shí)喹硫平有阻斷α1腎上腺素受體作用，可引起頭暈、直立性低血壓等不良反應(yīng)。為保證臨床療效，減少藥物不良反應(yīng)，臨床常進(jìn)行喹硫平的藥物濃度監(jiān)測，以血液標(biāo)本檢測最為常用[2-3]，但血液分析只能反映個(gè)體的短期用藥信息，且血液標(biāo)本易污染、保存需冷藏，而頭發(fā)標(biāo)本易保存，采集無創(chuàng)傷性，且檢測窗口長，可以反映患者的長期用藥史，從數(shù)周到數(shù)月、數(shù)年，甚至數(shù)十年。

本實(shí)驗(yàn)通過條件優(yōu)化，建立一種HPLC法用來測定人頭發(fā)中的喹硫平濃度，為臨床合理用藥及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 頭發(fā)樣品：頭發(fā)樣本來源于2015年4～5月無錫市精神衛(wèi)生中心住院精神分裂癥患者，共6名，均連續(xù)服用喹硫平3個(gè)月以上，其中男性3名，女性3名，年齡20～54歲。健康對照組5人，男3名，女2名，年齡21～55歲，從未服用過任何抗精神病藥物。所有入組者均為黑發(fā)，知情同意本實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 儀器：1260高效液相色譜儀：配G1311C溶液輸送泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316可調(diào)柱溫恒溫箱、G1314B二極管陣列紫外檢測器、Agilent色譜化學(xué)工作站(美國Agilent公司)；XS105電子分析天平和S20PH計(jì)(梅特勒-托利多儀器公司)；EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.1.3 藥品與試劑：喹硫平和安定標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：100815-201202，100364-200301)；甲醇為色譜純(TEDIA公司產(chǎn)品，批號(hào)：13090462)；洗潔精(上海和黃白貓有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：2014101011B)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。水為凈化超純水。

1.2 方法

1.2.1 頭發(fā)樣品的采集和清洗：入組者頭枕部貼頭皮處剪下一小簇頭發(fā)，取距離根部約5 cm的樣品。頭發(fā)樣品先用0.1% 洗潔精清洗1次，再用清水和二氯甲烷交替清洗2次，以去除頭發(fā)外部污染，自然晾干后剪成長約1 mm頭發(fā)粉末，待檢。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取喹硫平標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL定量瓶中，加甲醇溶解、搖勻后再加50%甲醇溶液定容至10 mL，作為喹硫平儲(chǔ)備液，濃度為1 g/L。以此儲(chǔ)備液為母液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。密閉避光4 ℃冷藏備用。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)工作液的配制：用50%甲醇將內(nèi)標(biāo)安定配制成0.02 g/L的內(nèi)標(biāo)工作液，4 ℃冷藏備用。

1.2.4 色譜條件：Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；檢測波長254 nm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.01 mol/L醋酸銨-甲醇(32︰68)，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6.0；流速：l mL/min；進(jìn)樣量25 μL。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取 10 mL 帶蓋錐形離心試管8個(gè)，分別加入 50 μL濃度分別為2×103、4×103、8×103、1.6×104、2.4×104、3.2×104、4.8×104、8×104ng/mL的喹硫平標(biāo)準(zhǔn)品溶液，氮?dú)獯蹈桑俜謩e加入 20 mg清洗干凈的空白頭發(fā)粉末，配制成頭發(fā)中的喹硫平濃度分別為 5、10、20、40、60、80、120、200 ng/mg頭發(fā)。然后各自加入安定內(nèi)標(biāo)工作溶液30 μL，加1 mol/L NaOH溶液2 mL，超聲水解90 min，用2 mol/L HCL調(diào)pH約8.0，離心，取上清液加正已烷3 mL，密塞，漩渦混勻萃取，離心后吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一試管中，50 ℃水浴中氮?dú)饬飨麓蹈?。殘留物?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，取25 μL進(jìn)樣分析。

1.2.6 回收率及精密度試驗(yàn)：取清洗干凈后的健康對照頭發(fā)粉末，按1.2.5方法制備喹硫平濃度為10、60、120 ng/mg頭發(fā)樣品，按文獻(xiàn)方法[4]測定。

1.2.7 喹硫平的穩(wěn)定性測定：按1.2.5方法分別配制喹硫平濃度為10、60、120 ng/mg樣品各4份，共12個(gè)樣品，每份樣品分別在室溫放置4 h，-20 ℃凍存1d，1周和1月后進(jìn)行樣品穩(wěn)定性測定。

1.3 臨床應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)組中6例患者,均口服喹硫平片,劑量分別為500、400、700、400、300、200 mg，按照1.2.5方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖 在1.2.4色譜條件下，喹硫平和安定均有很好的分離，頭發(fā)中雜質(zhì)對測定不產(chǎn)生干擾，2者的保留時(shí)間分別為4.35 min及5.76 min，測得喹硫平峰面積Ai、內(nèi)標(biāo)峰面積As，以Ai/As的值為橫坐標(biāo)(X)，以頭發(fā)樣品所對應(yīng)各點(diǎn)喹硫平濃度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 15.2237X+1.1564(r=0.9996)，n=8，頭發(fā)中喹硫平濃度在5～200 ng/mg頭發(fā)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，當(dāng)信躁比S/N=3時(shí)，喹硫平的檢測限可達(dá)到3ng/mg。見圖1。

圖1 頭發(fā)樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hair samples

2.2 回收率及精密度試驗(yàn) 測得喹硫平日內(nèi)及日間RSD均<10%，萃取回收率>75%，方法回收率在95.0%～105.0%之間，符合生物樣品分析要求。見表1。

加入濃度ng/mg萃取回收率(%)方法回收率(%)日內(nèi)精密度測定值(ng/mg)RSD(%)日間精密度測定值(ng/mg)RSD(%)1079.45103.6010.64±1.049.7710.25±1.019.856075.5796.1261.15±4.166.8059.67±4.277.1512075.1495.83117.13±7.726.59115.15±9.268.04

2.3 喹硫平的穩(wěn)定性，樣品穩(wěn)定性測定結(jié)果未見藥物喹硫平降解，RSD 均<10%。

2.4 臨床應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)組中6例患者頭發(fā)中均檢出藥物喹硫平，濃度分別為45.71、42.35、68.29、37.04、33.12、15.27 ng/mg，所建立的實(shí)驗(yàn)方法能夠用于臨床檢測。

3 討論

毛發(fā)中藥物檢測有著悠久的歷史。1954年，Goldblum等[5]首次報(bào)道在豚鼠毛發(fā)中檢出苯巴比妥。1992年Tracqui等[6]從頭發(fā)中檢出了抗抑郁藥阿米替林。近年來，隨著微量檢測技術(shù)的發(fā)展，毛發(fā)中藥物檢測日益受到重視，許多抗精神病藥、麻醉藥、物質(zhì)依賴藥物等都可以通過毛發(fā)進(jìn)行檢測[7-8]。

頭發(fā)表面會(huì)被汗液、油脂等多種物質(zhì)污染，因此，藥物檢測前需對頭發(fā)樣本進(jìn)行清洗。目前尚無統(tǒng)一的清洗程序，一般根據(jù)分析藥物的不同而采用不同的清洗溶劑。常用清洗溶劑有：洗潔精、二氯甲烷、丙酮、十二烷基磺酸鈉、異丙醇、吐溫等[9]。即使采用很復(fù)雜的清洗程序也無法完全除去外來污染物質(zhì)。一般認(rèn)為，如清洗溶劑中被分析物濃度遠(yuǎn)低于頭發(fā)中被分析物的濃度，則可忽略外源性的藥物污染[10]。另外清洗程序越多越復(fù)雜時(shí)，頭發(fā)內(nèi)的藥物也被洗出得越多。因此，對于很少產(chǎn)生環(huán)境污染的喹硫平來說，只需洗凈頭發(fā)表面的一般污染物，對HPLC測定背景無明顯干擾時(shí)即可。

頭發(fā)內(nèi)藥物緊密結(jié)合在頭發(fā)內(nèi)的髓質(zhì)，外有毛皮質(zhì)的保護(hù)，因此必須進(jìn)行前處理提取程序，才能使藥物釋放出來。頭發(fā)前處理常用的方法有酸化、堿化、酶解、甲醇提取，緩沖液超聲等，在提取過程中首要考慮藥物及其代謝物在不同水解系統(tǒng)下的穩(wěn)定性。對于喹硫平而言，采用條件溫和的酸性水解或單純緩沖液超聲，不能完全溶解頭發(fā)，提取回收率較低。甲醇水解、堿性水解、酶水解這3種處理方式均能溶解頭發(fā)，形成均一溶液。但甲醇的溶解能力很強(qiáng)，頭發(fā)中基質(zhì)及黑色素對本實(shí)驗(yàn)干擾明顯，影響檢測背景。雖然酶解提取回收率也高，但其成本過大。根據(jù)喹硫平在堿性條件不易被水解的結(jié)構(gòu)特性，本研究采取將頭發(fā)在不同濃度堿作用下進(jìn)行浸泡超聲提取，考察了0.1、0.5、1、2 mol/L氫氧化鈉等條件下的提取效率，發(fā)現(xiàn)以1 mol/L氫氧化鈉，作用90 min時(shí)效果最好，此時(shí)喹硫平提取回收率可大于75%。而當(dāng)堿濃度過低，過高或作用時(shí)間超過2 h后也會(huì)降低喹硫平的回收率。

喹硫平屬于二苯二氮類衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此紫外吸收明顯。實(shí)驗(yàn)過程中，用190～400 nm波長范圍內(nèi)對喹硫平標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)喹硫平在210 nm、254 nm 處有強(qiáng)吸收峰，因210 nm靠近末端吸收，容易受溶劑和雜質(zhì)的干擾，因此本實(shí)驗(yàn)波長選擇254 nm。

喹硫平可通過CYP450酶系參與代謝，其代謝物共有20種，其中7-OH喹硫平具有少量藥理活性。這些代謝物雖數(shù)量眾多，但濃度很小，實(shí)驗(yàn)中沒有對母藥喹硫平的測定帶來過多影響，故本次未作代謝物的濃度檢測。

本研究在堿性條件下水解提取頭發(fā)內(nèi)喹硫平，然后采用HPLC方法檢測。所建立的方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于頭發(fā)中喹硫平的藥物濃度檢測。

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[3] 張巧真.我院994例喹硫平血藥濃度日常檢測及藥師干預(yù)分析[J].中國藥房，2015，26(8)：120-1122.

[4] 張?jiān)来?，陳珉池，凌衛(wèi)明.高效液相色譜法與化學(xué)發(fā)光法測定血清丙戊酸鈉濃度的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23(15)：3051-3053.

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(編校：王冬梅)

Determination of quetiapine in human hair by HPLC

ZHANG Yue-chun1, SHI Lin-lin2, GU Li-ze1, SU Xu-jiang3, LU Zhen-lie3, LING Wei-ming1Δ

(1.Department of Clinical Laboratory, Wuxi Mental Health Center, Wuxi Tongren International Rehabilitation Hospital, Nanjing Medical University, Wuxi 214151, China; 2.Department of Nutritional, Tianjin Third Central Hospital, Tianjin 300170, China; 3.Department of Psychiatry, Wuxi Mental Health Center, Wuxi Tongren International Rehabilitation Hospital, Nanjing Medical University, Wuxi 214151, China)

ObjectiveTo establish a method for determinning quetiapine in human hair by HPLC.MethodsA reverse phase HPLC system was performed on Inertsil ODS-C18column (4.6 mm×150 mm,5 μm)with the mobile phase consisted of 0.01 mol/Lammonioum-methanol(32︰68).The flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 40 ℃,the detection wavelength was 254 nm.N-hexane was used as extracting solvent.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 5-200 ng/mg.for quetiapine.The recovery of extraction >75.0%, the recovery of method was between 95.0% and 105.0%, the intra-day and inter-day precision were all no more than 10.0%.This method met the requirements of biological samples.ConclusionA HPLC method of concentration of quetiapine in human hair is established, which is simple,sensitive,accurate and has a certain value.

hair; quetiapine; high performance liquid chromatography

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金(2013NJMU207)

張?jiān)来?，男，碩士在讀，副主任醫(yī)師，研究方向：臨床檢驗(yàn)，E-mail：zhangming5656@163.com；凌衛(wèi)明，通訊作者，男，本科，副主任技師，研究方向：臨床檢驗(yàn)，E-mail：lwmjyk888@sina.com。

R446.19

A

1005-1678(2015)09-0161-03