張育琳，馬冽，華子春

(南京大學 生命科學學院/江蘇省產業(yè)技術研究院醫(yī)藥生物技術研究所/南京市醫(yī)藥生物技術創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

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重組人BAFF的原核表達及純化

(南京大學 生命科學學院/江蘇省產業(yè)技術研究院醫(yī)藥生物技術研究所/南京市醫(yī)藥生物技術創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的 本研究對TNF家族B細胞激活因子(B cell activating factor to the TNF family, BAFF) 的胞外區(qū)134～285位氨基酸殘基進行克隆，構建原核表達載體pET21a-sBAFF，并進行表達及純化。方法 以K562細胞系的cDNA為模板，采用PCR擴增sBAFF基因，構建pET21a-sBAFF。在大腸桿菌BL21(DE3)中經IPTG誘導表達sBAFF，超聲碎菌，提取包涵體，經Ni2+-IDA親和層析純化，復性，采用SDS-PAGE鑒定純化產物。結果 通過優(yōu)化確定了目的蛋白適宜的誘導溫度和誘導時間。表達的sBAFF相對分子量約為18000，目的蛋白占菌體總蛋白的38.59%，且主要以包涵體的形式存在。經過蛋白復性后有38.14%的sBAFF聚合成了有活性的三聚體，代表錯誤折疊的二聚體含量極低。結論 建立了成功的復性工藝，目的蛋白經過復性后形成具有活性的三聚體，為進一步研究BAFF的生物學功能以及以BAFF為靶點的自身免疫疾病藥物開發(fā)奠定了基礎。

B細胞激活因子；cDNA克??；原核表達；蛋白純化

B細胞激活因子(B cell activating factor, BAFF; 又稱TNFSF13B, THANK, CD257, BLyS 或 TALL1) 是1999年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族中的一員，是與人體免疫有關的細胞因子[1-3]。BAFF由285個氨基酸組成，其中1～46位氨基酸為胞內區(qū)，47～73位氨基酸為疏水的跨膜區(qū)，74～285位氨基酸為胞外區(qū)。BAFF位于細胞內的N端缺少信號肽，C端在胞外，屬于Ⅱ型跨膜蛋白[1- 2]。BAFF主要表達在先天免疫細胞如單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及濾泡樹突細胞等。目前已知BAFF可與3種受體相互作用，分別是B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)[4- 5]、 跨膜激活物與親環(huán)素配體相互作用因子(transmembrane activator and CAML interactor, TACI)[6]及BAFF受體(BAFF receptor3, BAFF-R, 也叫 BR3)[7]。其中，BR3是BAFF的特異性受體，而TACI和BCMA同樣也是TNF超家族的另一成員APRIL的受體。BR3是唯一可被可溶性sBAFF三聚體激活的受體。同許多TNF家族成員一樣，sBAFF多以三聚體型式存在，與其受體相互作用，實現(xiàn)其生物學功能[8]。在中性或堿性條件下，20個三聚體型式的sBAFF可通過其“Flap區(qū)”相互結合，形成類似病毒顆粒的60聚體型式，并可在酸性條件下發(fā)生不可逆的分離[9-10]。BAFF的“Flap”環(huán)為其特有，其他TNF家族蛋白沒有此結構。三聚體形式的配體與其受體結合并不一定會激活下游信號通路，尤其是對于TACI，只有60聚體形式的BAFF才能激活它介導的生物學效應[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，BAFF的異常表達與自身免疫性疾病密切相關。BAFF表達量的高低影響到B細胞的存活信號通路及產生自身抗體的B細胞的選擇性凋亡[12]。普遍認為BAFF過表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)、干燥綜合征(Sj?gren’s syndrom, SS)等多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切關系[13-14]。因此BAFF及其受體有望成為治療相關性疾病的新靶點。BAFF可溶性形式為其發(fā)揮功能的主要區(qū)域，故本研究旨在對BAFF胞外區(qū)可溶性片段134～285位氨基酸殘基進行克隆，構建原核表達載體。通過IPTG誘導蛋白表達，經純化及復性得到目的蛋白，為體外研究sBAFF的結構與功能關系以及進一步探討其生物學功能奠定基礎，并為以BAFF與其受體為靶點的藥物設計提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質粒:質粒pET21a；大腸桿菌E.coli Top10，E.coli BL21(DE3)均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及耗材:DNA限制性內切酶 NdeI、XhoI，T4 DNA連接酶、DNA Marker購自Takara公司; KOD DNA Polymerase購自東洋紡(上海)生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自申能博彩生物工程公司; 蛋白胨、酵母浸膏購自Sigma公司; IPTG購自Sunshine 公司; 丙烯酰胺和雙甲叉丙烯酰胺、TEMED購Bio-Rad公司; Ni2+-NTA agarose購自Qiagen公司；透析袋購自南京晚晴公司(MW8-10 kDa)；相關引物由南京金斯瑞生物技術公司合成。

1.1.3 實驗儀器:高速離心機(CR22E，日本HITACHI公司)，超聲波細胞破碎儀(SCIENTZ-II D，寧波新芝生物科技股份有限公司)，恒流泵(BT-100，上海滬西分析儀器廠有限公司)，蛋白質紫外檢測儀(HD-7，南京普陽科學儀器研究所)，蛋白凝膠電泳儀(美國Bio-Rad)。

1.2 實驗方法

1.2.1 sBAFF基因的擴增:根據(jù)GenBank中編碼人sBAFF的cDNA序列，設計一對特異性引物，擴增編碼134～285位氨基酸序列，上游引物F為：5’-GGAATTCCATATGGTTCAGGGTCCAG-3’，下游引物R為：5’-CGGCTCGAGCAGCAGTTTCAATG-3’。其中F和R分別含有酶切位點Nde I和Xho I(下劃線標出)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以K562細胞的cDNA為模板，PCR擴增sBAFF基因，反應條件為：95 ℃預變性5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 重組表達載體pET21a-sBAFF的構建及鑒定:對PCR得到的片段及載體pET21a分別用限制性內切酶NdeI、XhoI進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶將sBAFF酶切產物連接到pET21a載體上，并將連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，進行菌落PCR和雙酶切鑒定，鑒定為陽性者提取重組質粒，由南京金斯瑞生物技術公司測序。

1.2.3 目的蛋白的表達及條件優(yōu)化:將測序正確的重組質粒pET21a-sBAFF轉化進大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達。將重組菌接種于含50 μg/mL氨芐霉素的3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)活化過夜。次日按1:100接種于50 μg/mL氨芐霉素的3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌體OD600約為0.6，加入IPTG至終濃度1 mM，分別在37 ℃下誘導表達5 h和20 ℃下誘導表達16 h。誘導結束后取菌液3 mL，離心去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后用適量PBS重懸。菌液經超聲破碎后(超聲功率400 W，超聲2 s，間歇2 s，總時間1 min)，12000 r/min 離心5 min，分離上清液和沉淀，沉淀用等量PBS重懸。分別取菌液、上清液、沉淀制樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析目標蛋白的表達量和可溶性情況。

1.2.4 Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白:確定了目的蛋白適宜的誘導溫度和誘導時間后，分別將含有重組質粒pET21a-sBAFF的表達菌在500 mL LB培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)并誘導表達。離心收集菌體，PBS洗滌2次后用40 mL PBS重懸，冰浴超聲破碎直至菌液呈半透明，于4 ℃，12000 r/min離心15 min，收集包涵體沉淀。向沉淀包涵體加入4 mL含有8 mol/L尿素和10 mmol/L PMSF的PBS，于冰上攪拌溶解，4 ℃，12000 r/min離心15 min，留取上清。首先將Ni2+-NTA親和層析柱用Binding Buffer(含有8 mol/L 尿素的PBS)平衡。以0.2 mL/min的流速緩慢上樣，使蛋白能夠與柱子充分結合。用Binding Buffer平衡柱子5個柱體積后，用Washing Buffer(含有8 mol/L 尿素，50 mmol/L咪唑的PBS)洗脫雜蛋白。用含有不同濃度咪唑的Elution Buffer(含有8 mol/L尿素，200/500 mmol/L 咪唑的PBS)洗脫目的蛋白。收集各組分的洗脫液進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析目的蛋白的洗脫情況。

1.2.5 蛋白的透析復性:將透析袋于含2%NaHCO3和1 mmol/EDTA的溶液中煮10 min，用ddH2O沖洗干凈，再于1 mmol/L EDTA的溶液中煮10 min，用ddH2O沖洗干凈。將含有純度較高的目的蛋白的洗脫緩沖液裝入預處理的透析袋中。復性緩沖液由含不同濃度的尿素(6、4、2、1、0 mol/L)和0.1 mmol/L PMSF的PBS組成。目的蛋白在4 ℃經上述尿素濃度不斷降低的復性緩沖液中攪拌透析，每次8 h，使變性的目的蛋白在此過程中自然復性，從而得到有活性的目的蛋白。透析結束后，經SDS-PAGE凝膠電泳鑒定其復性效果。

2 結果

2.1 sBAFF基因擴增產物的鑒定 以K562細胞的cDNA為模板，設計含有特定酶切位點的特異性引物，對BAFF的134～285位氨基酸進行擴增，預期擴增產物sBAFF大小分別約為468 bp。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳后，可見條帶清晰單一，片段大小與預期結果一致，結果見圖1。

圖1 sBAFF擴增的PCR產物M：DNA marker；1：sBAFFFig.1 Amplification of sBAFF by PCRM: DL2000 DNA Marker; 1: sBAFF

2.2 重組表達質粒的鑒定 經抗生素篩選和菌落PCR鑒定得到陽性重組子pET21a-sBAFF。質粒載體中含有T7啟動子序列，采用T7引物進行測序。測序結果采用BLAST程序進行比對分析，確定與預期相符，成功將“Flap”區(qū)進行了有效突變。

2.3 目的蛋白的表達及條件優(yōu)化 將構建成功的重組原核表達質粒pET21a-sBAFF轉化大腸桿菌BL21(DE3)后，在1 mmol/L IPTG濃度下，分別在37 ℃下誘導表達5 h和20 ℃下誘導表達16 h。經SDS-PAGE分析表明，目的蛋白在2種不同誘導條件下都得到了有效表達，相對分子量約為18000，在菌體內主要以包涵體形式存在，見圖2和圖3。進一步灰度掃描顯示，在37 ℃誘導5 h下，目的蛋白sBAFF的表達量占菌體總蛋白的32.16%，其中可溶的sBAFF占菌體上清總蛋白的19.02%。而低溫20 ℃誘導16 h下，目的蛋白的表達量有所提高，sBAFF的表達量占菌體總蛋白的38.59%，其中可溶的sBAFF占菌體上清總蛋白的30.89%。說明20 ℃低溫誘導不僅有利于增加目的蛋白的可溶性表達，而且有利于增加目的蛋白的總表達量。

圖2 SDS-PAGE分析目的蛋白在37 ℃下的表達M：蛋白Marker；1：菌體總蛋白；2：上清；3：沉淀Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant target protein expressed at 37 ℃M: Protein molecular weight marker; 1: Total protein; 2: Supernatant; 3: Sediment

圖3 SDS-PAGE分析目的蛋白在20 ℃下的表達M：蛋白Marker；1：菌體總蛋白；2：上清；3：沉淀Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant target protein expressed at 20 ℃M:Protein molecular weight markers；1: Total cellular proteins;2:Supernatant;3:Pellets

2.4 目的蛋白的純化 目的蛋白主要以包涵體的形式存在，分離包涵體沉淀后在變性條件進行蛋白純化。包涵體溶解物經Ni2+-NTA親和層析柱純化，得到純度較高的目的蛋白。對不同咪唑濃度的洗脫收集液進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果顯示sBAFF在200 mmol/L咪唑洗脫下蛋白純度較高，達到86.48%，見圖4。因而收集純度較高的目的蛋白進行后續(xù)的復性。

圖4 純化蛋白的SDS-PAGE分析1：菌體總蛋白；2：雜蛋白洗脫液；3：200 mmol/L咪唑洗脫液；4：1 mol/L咪唑洗脫液；M：蛋白markerFig.4 SDS-PAGE analysis of purified proteins1: Total proteins; 2: Wash fraction; 3: Eluent of 200 mmol/L imidazole; 4: Eluent of 1 mol/L imidazole; M: Protein molecular weight markers

2.5 目的蛋白的復性 對收集的目的蛋白采取逐步降低尿素濃度的方法進行透析，除去蛋白溶液中的尿素，使變性的目的蛋白緩慢地進行自然復性。復性后的目的蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果顯示除了18 kDa處的條帶外，在54 kDa處可見第二條條帶，從分子量大小估計應為三聚體。因此，復性后的目的蛋白單體形成了有活性的三聚體，見圖5。而凝膠掃描圖像的灰度分析顯示，經過蛋白復性后有23.75%的sBAFF聚合成了三聚體。蛋白濃縮后，sBAFF的三聚體提高到了38.14%。最終，目的蛋白總產率為10.86 mg/L。

圖5 蛋白復性的SDS-PAGE分析M：蛋白marker；1,2：濃縮后sBAFF；3,4：未濃縮sBAFFFig.5 SDS-PAGE analysis of protein complex M: Protein molecular weight marker; 1, 2: Concentrated refolded sBAFF; 3, 4: Non-concentrated refolded sBAFF

3 討論

BAFF的異常表達與自身免疫性疾病密切相關，故已成為治療自身免疫疾病的新藥物靶點。目前， BAFF抑制劑主要是針對類風濕性關節(jié)炎、SLE和多發(fā)性硬化癥三類疾病。隨著研究的不斷深入，對于BAFF形式多樣性的理解也更加豐富。BAFF相關的抑制劑也從最早針對sBAFF的特異性抗體藥物Belimumab，發(fā)展到其它各種抗體類藥物和融合蛋白類藥物，如atacicept (TACI-Ig融合蛋白)等，再到針對sBAFF和膜結合BAFF的blisibimod等。

在本研究中，構建了sBAFF胞外區(qū)的原核表達質粒pET21a-sBAFF，以期望在體外模擬BAFF及其多聚體形式。本文通過摸索不同誘導溫度和表達時間，探究不同表達條件對目的蛋白表達的影響，確定合適的誘導條件，以提高目的蛋白的產量。在20 ℃下誘導表達16 h，sBAFF得以有效表達，其表達量顯著提高，從37 ℃下表達占菌體總蛋白的32.16%，提高到20 ℃下的38.59%，表達量提高了約20%。由于BAFF單體分子量較小，且含有一對二硫鍵，因此目的蛋白主要以包涵體形式表達。但是與37 ℃表達相比，降低表達溫度可提高可溶性蛋白的含量，從37 ℃下可溶性占菌體上清蛋白的19.02%，提高到20 ℃下的30.89%，可溶性蛋白的表達量提高了約62.41%。因此，首先對20 ℃下表達的可溶性目的蛋白進行純化，利用融合蛋白帶有His標簽的特征，使用Ni2+-NTA親和層析進行純化。然而在純化過程中，目的蛋白未能有效結合到Ni柱上，可能是由于目的蛋白上融合的His標簽在蛋白折疊過程中被包裹在蛋白內部而未能暴露，從而導致不能有效與Ni結合。因此，通過對包涵體進行變性溶解，打開蛋白折疊的高級結構，暴露His標簽，再使用Ni2+-NTA親和層析進行純化得到了純度較高的目的蛋白，為后期研究蛋白活性提供了可能。在對變性蛋白復性透析過程中，采取了逐步降低尿素濃度的方法，使目的蛋白重新緩慢進行正確折疊恢復其生物學活性。而BAFF單體內有一對分子內二硫鍵存在，如果二硫鍵發(fā)生錯配，則會產生二聚體及基于二聚體的多聚體形式。同時，有活性的BAFF是以三聚體的形式存在的，故在復性過程中，BAFF單體能否有效聚合成三聚體與其恢復生物學活性密切相關，而有無二聚體存在則能夠反映復性過程中是否發(fā)生了錯誤折疊。復性后的sBAFF經過SDS-PAGE分析顯示蛋白主要以單體和三聚體形式存在，有38.14%的sBAFF聚合成三聚體，而代表發(fā)生錯誤折疊的二聚體含量極低，約1.21%，這說明本實驗的復性工藝是成功的。如何進一步優(yōu)化復性工藝、獲得更高比例有活性的三聚體尚需進一步努力，以取得更加理想的效果。

本研究中，sBAFF的成功構建和表達、以及復性工藝的建立，為進一步在體外研究BAFF的作用機制奠定了初步的基礎。同時為以BAFF為靶點的自身免疫性疾病的新型藥物開發(fā)創(chuàng)造了條件。

致謝

感謝常州市科技局(CZ20130011、CE20135013、CZ20120004、CM20122003)，武進區(qū)科技局(WF201207)資助。

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(編校：譚玲)

Expression and Purification of recombinant soluble human BAFF

ZHANG Yu-lin, MA Cai-lie, HUA Zi-chunΔ

(School of Life Science, Nanjing University,Pharmaceutical Biotechnology Research Institute of Jiangsu Industrial Technology Research, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo construct pET21a-sBAFF by cloning the extracellular regions of 134-285 amino acids of BAFF, a member of human TNF family, and then express the gene in prokaryotic cells and purify the expressed product.MethodscDNA of K562 cell line was used as the template to amplify sBAFF gene to construct pET21a-sBAFF.Expression of sBAFF inE.coli BL21 was induced by IPTG, and the expressed proteins were assayed by SDS-PAGE.The bacteria were analyzed by sonication, and the target proteins mainly existed as inclusion bodies.Then sBAFF was purified by Ni2+-IDA affinity chromatography.SDS-PAGE electrophoreses displayed that the expressed sBAFF migrated with a relative molecular weight of 18000.ResultsThe induction parameters such as temperature and inducing time were optimized.The target protein accounted for 38.59% of the total bacterial proteins.After refolding, 38.14% of sBAFF proteins were polymerized as an active trimer.The dimer form of sBAFF, which is representative of wrongly refolded product, accounted for very few.ConclusionThe expression and purification of BAFF which formed active trimer after refolding pave the way for its further function study and provide a novel approach for the development of BAFF-targeted therapeutics for autoimmune diseases.

B cell activating factor; cDNA cloning; prokaryotic expression; protein purification

國家高技術研究發(fā)展計劃(2012AA020304)、江蘇省科技支撐計劃-社會發(fā)展項目(BE2013630)

張育琳，女，碩士，研究方向：蛋白質純化，E-mail:shirley9051@hotmail.com；華子春，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：細胞生物學，E-mail：huazc@nju.edu.cn。

R392

A

1005-1678(2015)07-0001-04