宋佰慧，崔昊震，張默函

(1.長春醫(yī)學高等?？茖W校 基礎(chǔ)醫(yī)學部，吉林長春 130031；2.延邊大學 中醫(yī)學院，吉林延吉 133000； 3.延邊大學 醫(yī)學院，吉林延吉 133000)

?

澤蘭乙醇提取物對STZ誘導糖尿病小鼠腎臟的保護作用

宋佰慧1，崔昊震2，張默函3Δ

(1.長春醫(yī)學高等?？茖W校 基礎(chǔ)醫(yī)學部，吉林長春 130031；2.延邊大學 中醫(yī)學院，吉林延吉 133000； 3.延邊大學 醫(yī)學院，吉林延吉 133000)

目的 探討澤蘭乙醇提取物對鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導糖尿病小鼠腎臟的保護作用及機制。方法 小鼠一次性腹腔注射STZ溶液0.12 mg/g誘導糖尿病模型，60 h后將造模成功的小鼠隨機分為3組，模型對照組、澤蘭乙醇提取物高劑量組[5.0 g/(kg·d)]和澤蘭乙醇提取物低劑量組[1.25/(kg·d)]，每組10只，另取正常對照組小鼠10只。澤蘭乙醇提取物高、低劑量組灌胃對應(yīng)劑量澤蘭乙醇提取物，正常對照組及模型對照組小鼠灌胃相同體積無菌蒸餾水，灌胃飼養(yǎng)5周后，采用過碘酸-雪弗氏(periodic acid Schiff reaction，PAS)染色法檢測各組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)，ELISA檢測腎組織晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，同時應(yīng)用RT-PCR和Western blot法檢測各組實驗小鼠腎臟單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的表達。結(jié)果 PAS染色顯示，與模型對照組比較，腎臟結(jié)構(gòu)改變明顯。ELISA結(jié)果顯示，模型對照組腎臟組織中AGEs、TGF-β1含量均高于正常對照組(P<0.01)，顯著低于模型對照組(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示模型對照組MCP-1 mRNA表達高于正常對照組(P<0.01)，澤蘭乙醇提取物高、低劑量組低于模型對照組(P<0.01)，低于澤蘭乙醇提取物低劑量組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示MCP-1蛋白表達模型對照組高于正常對照組(P<0.01)，但澤蘭乙醇提取物高、低劑量組與模型對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 澤蘭乙醇提取物對STZ誘導糖尿病小鼠腎臟具有保護作用，其機制可能與下調(diào)AGEs-MCP-1-TGF-β1表達有關(guān)。

澤蘭；糖尿病；腎臟；晚期糖基化終末產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化生長因子β1；單核細胞趨化蛋白-1

糖尿病患者多存在腎臟結(jié)構(gòu)的改變，且此改變是糖尿病腎病發(fā)生的基礎(chǔ)[1]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)作為糖基化終產(chǎn)物，可以改變細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成，在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病過程中可使腎小球支架結(jié)構(gòu)孔架增大，通透性增高。研究表明AGEs可以誘導腎小球系膜細胞單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)表達增強[2]。MCP-1是已被證實的最強的趨化和激活單核細胞的因子，其引起的炎癥反應(yīng)在DN的發(fā)病過程中，可引起腎血管損傷、腎基質(zhì)纖維化以及腎組織結(jié)構(gòu)重建[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可導致腎小球基底膜增厚及細胞外基質(zhì)堆積。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1能夠活化糖尿病腎組織中巨噬細胞，增加TGF-β1分泌，促進DN的發(fā)生[4]。因此通過干預AGEs-MCP-1-TGF-β1途徑，可對糖尿病腎病具有一定的治療作用。澤蘭作為常用的中藥材，因其功能多、副作用小，而常被用于治療糖尿病及其并發(fā)癥[5]。將澤蘭與糖尿病的腎臟結(jié)構(gòu)改變聯(lián)合進行研究至今未見文獻報道。本研究利用組織化學、ELISA及分子生物學相關(guān)實驗技術(shù)，觀察了澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟結(jié)構(gòu)的改變、腎臟組織中AGEs與TGF-β1含量及MCP-1表達變化的影響，旨在為臨床澤蘭治療糖尿病腎病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：清潔級雄性成年昆明小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量23～25 g，由延邊大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK(吉)2011-0007。

1.1.2 藥物與試劑：澤蘭(北京同仁堂)；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，美國Sigma公司)；小鼠AGEs ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)試劑盒檢測測定有限公司)；小鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(上海繼錦化學科技有限公司)；過碘酸-雪弗氏(periodic acid Schiff reaction，PAS)染液(北京雷根公司)；小量柱離心式組織總RNA提取純化試劑盒(美國Promega公司)；一步法RT-PCR試劑盒(美國Promega公司)；MCP-1與β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)；辣根過氧化物標記IgG抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.1.3 儀器：BIO-RAD iMark酶標儀(美國伯樂公司)； Mastercylernexus型PCR儀(德國Eppendorf公司)；Gel Doc XR凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司 )；Western blot轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備澤蘭乙醇提取物[6]：澤蘭干燥后切碎，8倍藥物體積的95%乙醇浸泡(≥12 h)，后分別用6倍、5倍藥物體積的95%乙醇回流提取，各次時間分別為2、1.5、1 h。合并并過濾提取液，濃縮至浸膏后備用。

1.2.2 制備糖尿病小鼠模型：實驗用小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食24 h，自由飲水。按照0.12 mg/g用量腹腔注射新配制的檸檬酸緩沖液溶解的STZ溶液(濃度為20 mg/mL)。飼養(yǎng)條件不變，再喂養(yǎng)60h后，禁食不禁水12 h，斷尾取血，空腹血糖值(FBG)≥11.1 mmol/L表明糖尿病小鼠模型制備成功[6-7]。

1.2.3 動物分組及處理：正常對照組小鼠10只，糖尿病小鼠隨機分為模型對照組、澤蘭乙醇提取物高劑量組和澤蘭乙醇提取物低劑量組。澤蘭乙醇提取物高劑量組(濃度為40 mg/mL)和澤蘭乙醇提取物低劑量組(濃度為10 mg/mL)分別按 5.0 g/(kg·d)、1.25 g/(kg·d)灌胃澤蘭乙醇提取物，正常對照組、模型對照組分別灌胃相同體積無菌蒸餾水，實驗期間各組小鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水，實驗周期為5 w。將小鼠脫頸處死后，迅速剖腹取出腎臟，部分投入液氮后備用，部分洗凈、拭干，投入4 ℃Carnoy氏液中固定。

1.2.4 組織化學觀察：將腎臟組織于4 ℃ Carnoy氏液中的固定6～8 h后，切塊、脫水、透明、石蠟包埋、切片(5 μm)、脫蠟水化，然后進行過碘酸-雪弗氏(PAS)染色。染色后觀察腎小球基底膜變化[8]。

1.2.5 ELISA法檢測腎組織AGEs與TGF-β1：取腎組織加入適量生理鹽水勻漿，3000 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒操作步驟結(jié)合酶標儀進行檢測。

1.2.6 RT-PCR法檢測MCP-1 mRNA：Trizol提取新鮮腎臟組織總RNA 10 μg，按照RT-PCR試劑盒要求進行實驗。引物序列：MCP-1上游5′-CACCTGCTGCTACTCATTCACT-3′，下游5′-GTTCTCTGTCATACTGGTCACTTC-3′，349bp，58 ℃；β-actin上游5′-CACCCGCGAGTACAACCATC-3′，下游 5′-TCTAGAAAGTGTG-GTGCCAA-3′，338 bp，62 ℃。反應(yīng)條件：48 ℃反轉(zhuǎn)錄45 min，94 ℃滅活禽成髓細胞白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶活性及引物變性2 min，然后94 ℃ 30 s，各退火1 min，68 ℃ 2 min，循環(huán)40次，68 ℃ 7 min，4 ℃冷卻。凝膠成像分析系統(tǒng)成像，以β-actin為參考，計算MCP-1 mRNA的相對含量。

1.2.7 Westen blot法檢測MCP-1蛋白：按照小量組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，全波長分光光度計測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2 min，40 μg加樣。10%SDS-PAGE電泳分離后，利用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1% Tween 20，pH 7.5)，封閉PVDF膜后洗膜。兔抗小鼠MCP-1多克隆第一抗體(1:500)，4 ℃過夜，洗滌后加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1:1 000)，室溫下孵育1 h，洗膜。凝膠成像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為參考，計算MCP-1蛋白的相對含量。

2 結(jié)果

2.1 澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟結(jié)構(gòu)變化的影響 PAS染色結(jié)果顯示，正常對照組腎小球基底膜呈現(xiàn)均質(zhì)狀，PAS陽性反應(yīng)強且分布均勻。模型對照組腎小球陽性染色增強，區(qū)域增寬，基底膜增厚，且細胞腫脹，部分內(nèi)皮細胞增生、變形。澤蘭乙醇提取物高劑量組上述改變明顯，接近正常對照組。澤蘭乙醇提取物低劑量組改變輕微與模型對照組相似。見圖1。

圖1 各實驗組腎臟結(jié)構(gòu)變化結(jié)果(×200)Fig.1 Results of kidney structure in each group(×200)

2.2 澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟AGEs含量的影響 ELISA結(jié)果顯示，模型對照組腎臟組織中AGEs和TGFβ-1含量高于正常對照組(P<0.01)；澤蘭乙醇提取物高劑量組顯著低于模型組(P<0.05)。其他組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組小鼠腎臟AGEs和TGF-β1含量比較Tab.1 Comparison of AGEs and TGF-β1 content among each ±s)

**P<0.01，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group

2.3 澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟MCP-1 mRNA表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，模型對照組MCP-1 mRNA相對表達量高于正常對照組(P<0.01)；澤蘭乙醇提取物高、低劑量組MCP-mRNA均顯著低于模型對照組(P<0.05)，均顯著高于空白對照組(P<0.05，P<0.01)，且澤蘭提取物高低劑量組之間亦有顯著差異(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 澤蘭乙醇提取物對各實驗組MCP-1 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Lycopus lucidus Turcz ethanol extract on MCP-1 mRNA expression

組別只數(shù)MCP-1mRNA正常對照組100.14±0.07模型對照組100.37±0.05**澤蘭乙醇提取物高劑量組100.21±0.07*##△澤蘭乙醇提取物低劑量組100.28±0.09**##

**P<0.01，*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；##P<0.01，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與澤蘭提取物低劑量組比較，compared with low-dose group

2.4 澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟MCP-1蛋白表達的影響 MCP-1蛋白相對表達量，模型對照組高于正常對照組(P<0.01)；澤蘭乙醇低劑量組高于正常對照組(P<0.01)；其他組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義。見圖3、表3。

圖3 澤蘭乙醇提取物對各實驗組MCP-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Lycopus lucidus Turcz ethanol extract on MCP-1 protein expression

組別只數(shù)MCP-1蛋白表達正常對照組100.07±0.03模型對照組100.14±0.03**澤蘭乙醇提取物高劑量組100.10±0.04澤蘭乙醇提取物低劑量組100.13±0.07**

**P<0.01，與正常對照組比較，compared with normal control group

3 討論

糖尿病腎病是常見的糖尿病并發(fā)癥，腎臟組織結(jié)構(gòu)的改變則是其發(fā)病的基礎(chǔ)，考慮其原因可能為高糖的長期作用引起的物質(zhì)代謝紊亂、微循環(huán)紊亂以及相關(guān)細胞因子表達異常引起[1]。AGEs是由脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)與葡萄糖生成的穩(wěn)定的共價化合物，與受體結(jié)合后可激活多條信號途徑，并增加諸如MCP-1的釋放和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。AGEs的清除依賴正常的腎功能，腎功能的破壞將導致AGEs在體內(nèi)沉積。MCP-1是由內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、腎小球系膜細胞等分泌產(chǎn)生的。生理條件下MCP-1呈低水平表達；糖尿病狀態(tài)下由于高血糖等影響因素的持續(xù)刺激使其表達明顯上調(diào)。上調(diào)的MCP-1可通過直接或間接的方式刺激細胞產(chǎn)生TGF-β1[9]。TGF-β1是一種強致纖維化因子，被認為在DN的發(fā)病過程中具有中心作用[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，澤蘭乙醇提取物高劑量組糖尿病小鼠腎臟結(jié)構(gòu)恢復明顯，而低劑量組則變化不明顯。這表明澤蘭乙醇提取物對糖尿病小鼠腎臟具有一定的保護作用。那么澤蘭對于糖尿病腎臟結(jié)構(gòu)的這種改變是通過何種方式或途徑實現(xiàn)的？為此本研究檢測了糖尿病小鼠腎組織AGEs與TGF-β1含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澤蘭乙醇提取物可以降低2者在腎組織中的含量，且高劑量作用明顯(P<0.05)。因此，本研究認為澤蘭乙醇提取物保護腎臟的作用，可能是通過下調(diào)AGEs與TGF-β1途徑實現(xiàn)的。研究已證實AGEs作為上游因子可以影響TGF-β1的表達。即澤蘭乙醇提取物是通過下調(diào)AGEs而減少了TGF-β1的分泌。為了探討具體機制，本研究還從基因和蛋白2個層面檢測了腎組織MCP-1 mRNA的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)澤蘭乙醇提取物可以降低MCP-1 mRNA的表達(P<0.05)。

綜上所述，本研究認為澤蘭乙醇提取物可以恢復腎小球濾過膜、抑制腎小球纖維重建，可能是通過以下途徑完成：①恢復腎組織細胞功能，減少AGEs含量，使腎組織細胞MCP-1表達下降，進而降低內(nèi)皮細胞、系膜細胞TGF-β1分泌量；②澤蘭乙醇提取物相關(guān)成分改變AGEs結(jié)構(gòu)，使其不能與受體結(jié)合，減少下游因子MCP-1、TGF-β1的分泌或澤蘭乙醇提取物直接作用相關(guān)細胞減少MCP-1、TGF-β1的產(chǎn)生。至于具體是澤蘭中哪種成分發(fā)揮的作用，本課題組將在后續(xù)研究中探討。

[1] 馮英凱.糖尿病腎病微炎癥及其抗炎藥物的研究進展[J].中國藥房，2014，25(1)：85-88.

[2] Singh VP,Bali A,Singh N,et al.Advanced glycation end products and diabetic complications[J].Korean J Physiol Pharmacol,2014,18(1):1-14.

[3] Driss V,Quesnel B,Brinster C.Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) contributes to thymus atrophy in acute myeloid leukemia[J].Eur J Immunol, 2015，45(2)：396-406.

[4] Docherty NG,Murphy M,Martin F,et al.Targeting cellular drivers and counter-regulators of hyperglycaemia- and transforming growthfactor-β1-associated profibrotic responses in diabetic kidney disease[J].Exp Physiol,2014,99(9):1154-1162.

[5] 楊芳，李敬林，依秋霞，等.益氣解毒活絡(luò)方對早期糖尿病腎病大鼠的防治作用[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(11)：165-169.

[6] 宋佰慧，程云龍，辛禧瑞，等.蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝臟糖原含量及糖原合成酶的影響[J].天津醫(yī)藥，2014，42(1)：65-67.

[7] Xu DY,Liu L,Cai YL,et al.Natriuretic peptide dependent cGMP signal pathway potentiated relaxation of gastric smooth muscle in streptozotocin-induced diabetic rat[J].Dig Dis Sci,2010,55(3):589-595.

[8] 趙熒，唐軍民.形態(tài)學實驗技術(shù)[M].北京：北京大學醫(yī)學出版社，2008：157-162.

[9] Gnudi L.A new chance to beat diabetic kidney disease:innate immunity and MCP-1:a matter of good and bad macrophages?[J].Nephrol Dial Transplant,2015,30(4):525-527.

[10] Zarjou A,Agarwal A.Heme oxygenase-1 as a target for TGF-β in kidney disease[J].Semin Nephrol,32(3):277-286.

(編校：王儼儼)

Protective effect of Lycopus lucidus Turcz ethanol extract on kidney in STZ induced diabetic mice

SONG Bai-hui1, CUI Hao-zhen2, ZHANG Mo-han3Δ

(1.Department of Basic Medicine, Changchun Medicine College, Changchun 130031, China; 2.College of Traditional Chinese Medicine, Yanbian University of Traditional Chinese Medicine, Yanji 133000, China; 3.College of Medicine, Yanbian University, Yanji 133000, China)

ObjectiveTo study the protective effect and mechanism of Lycopus lucidus Turcz ethanol extract on STZ induced diabetic mice kidney.MethodsThe diabetic mice model were induced by single intraperitoneal injection of 0.12 mg/g STZ.After 60h, the mice successful modeling were divided into model control group,Lycopus lucidus Turcz ethanol extract high-dose group [5.0g/(kg·d)]and low-dose group [1.25/(kg·d)], 10 mice in each group.Another 10 normal mice were used as normal control group.The high-and low-dose group were intragastric administrated corresponding dose Lycopus lucidus Turcz ethanol extract, normal control group and model control group were given the same volume of sterile distilled water.After 5 weeks, the mice kidney structure was observed by periodic acid-Schiff (PAS), advanced glycosylation end products(AGEs) and transforming growth factor β1 (TGF-β1) in kidney tissue were detected by ELISA.The monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) mRNA expression were detected by RT-PCR and MCP-1 protein expression by Western blot in mice kidney.ResultsPAS staining results showed, compared with model control group,renal structural changes in high-dose group was significantly increased.ELISA results showed AGEs and TGF-β1 content in kidney tissue of model control group were higher than normal control group (P<0.01), the above indexes of high-dose group were lower than model control group (P<0.05).RT-PCR results showed MCP-1 mRNA expression of model control group was higher than normal control group (P<0.01), MCP-1 mRNA expression of low- and high-dose group model group were lower than model control group (P<0.01), and MCP-1 mRNA expression of high-dose group was lower than low-dose group (P<0.05).Western blot results showed MCP-1 protein expression of model group was higher than normal control group (P<0.01), but there were no significant differences of MCP-1 protein expression between low- or high-dose group model group and model control group.ConclusionLycopus lucidus Turcz ethanol extract can protect the STZ-induced diabetic mice kidney, and it might be the reason of inhibiting the expression of AGEs-MCP-1- TGF-β1.

Lycopus lucidus Turcz; diabetes; kidney; advanced glycation end-products; transforming growth factor-β1; monocyte chemotactic protein-1

國家自然科學基金(81460643)

宋佰慧，女，碩士，講師，研究方向：中藥與糖尿病，E-mail：sbhyhy2008@163.com；張默函，通訊作者,男，碩士，講師，研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥,E-mail：mhzhang@ybu.edu.cn。

R587.1

A

1005-1678(2015)05-0014-04