佟海英 范盎然 于 雪 張?jiān)?烏吉斯古冷 李 婧 呼日樂巴根

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

孟根烏蘇(水銀)-18 味丸(簡孟根烏蘇-18 味丸)由水銀(制)、文冠木膏、硫黃(制)等18 味藥組成，臨床用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、布病、皮癬、痛腫瘡瘍、疥癬、瘰疬、鼠瘡，以及各種皮膚病，效果顯著。其主要成分為孟根烏蘇(水銀)炮制品(簡孟根烏蘇炮制品)，占11.24%〔1，2，3，4〕。由于孟根烏蘇-18 味丸含汞(Hg)等重金屬，其安全性問題尤為突出，臨床應(yīng)用受到了一定的限制。然而，對其Hg、鉛(Pb)等重金屬含量尚缺乏含量測定研究，本文應(yīng)用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)法測定成方中Hg、鐵(Fe)、鈣(Ca)、銅(Cu)、Pb 等5 種金屬元素含量，并對復(fù)方進(jìn)行小鼠急性實(shí)驗(yàn)研究，以期為后續(xù)更深入的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 種金屬元素含量測定

1.1.1 儀器與試藥：微波消解儀Ethos，意大利Milestone公司;電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP -OES)，IRIS 型號：Intrepid II XSP，美國ThermoFisher 公司。所用玻璃器皿等用具均在10%硝酸中浸泡24h 后，依次用去離子水、超純水沖凈后晾干備用。硝酸(BV - III 級);HClO4(分析純);Ca、Fe、Cu、Pb、和Hg 的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院，原始濃度均為1000μg/ml。

孟根烏蘇-18 味丸分別收集于國家蒙藥制劑中心內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品1，批號：20110511)，國家蒙藥制劑中心內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品2，批號：20111024)，內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品3，批號：20120916)，巴彥淖爾市蒙醫(yī)院(樣品4，批號：08174)，鄂溫克族自治旗蒙醫(yī)院(樣品5，2012.3 購買)，巴林右旗蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品6，批號：110629)，鑲黃旗蒙醫(yī)院(樣品7，2012.6購買)，興安盟蒙醫(yī)院(樣品8，批號：20090218)，庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品9，批號：091214)，庫倫旗蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品10，批號：110714)，杭錦旗蒙醫(yī)院外用(樣品11，2012.6 購買)，杭錦旗蒙醫(yī)院內(nèi)服(樣品12，2012.6 購買)，四子王旗醫(yī)院(樣品13，2012.2 購買)，錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品14，批號：121213)，呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院(樣品15，批號：20120905)，呼倫貝爾市蒙醫(yī)學(xué)校附屬蒙醫(yī)院(樣品16，批號：20110617)，呼倫貝爾市人民醫(yī)院(樣品17，批號：20100402)，烏蘭浩特中蒙藥制劑有限公司(樣品18，批號：20050901)，內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院簡化方(樣品19，2012年5月制備)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.2.1 儀器工作條件：ICP-OES 工作條件：等離子體功率：1150W，霧化氣壓力：26.0PSI，輔助氣流量：1.0LPM，蠕動泵轉(zhuǎn)數(shù)：100r/min。

1.1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制：分別精密吸取Bi、Sc、Y 內(nèi)標(biāo)溶液適量，用5%硝酸稀釋，制成每1ml 各含1μg 的混合溶液。

1.1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：ICP -OES 測試標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用從國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院購買的單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度分別為0、1、10、50mg·L-1(5%的硝酸介質(zhì))的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用ICP 光譜儀測定各種元素不同濃度的吸收值并繪制各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析得出各元素每一濃度下檢測值的RSD 值都在2%以下，所有測定元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的R 值都在0.999 以上。

1.1.2.4 樣品處理：取真空干燥6h 的孟根烏蘇-18 味丸粉末約0.1g，精密稱定，置潔凈干燥的聚四氟乙烯內(nèi)管中，加入濃硝酸2ml，在蒸汽浴上預(yù)消解10min。冷卻后繼續(xù)加入高氯酸5ml，蓋好聚四氟乙烯罐蓋，裝入微波消解儀中，設(shè)定消解程序，進(jìn)行樣品消解。待消解完畢并冷卻后，取出內(nèi)管，將澄清的消化液傾入25ml 量瓶中，用適量5%硝酸洗滌內(nèi)管數(shù)次，洗液并入25ml 量瓶中，加5%硝酸至刻度，搖勻。精密量取消化液0.2ml，轉(zhuǎn)移至500ml 量瓶中，加5%硝酸至刻度，搖勻，即得樣品溶液。同法制備10 份空白溶液。

1.1.2.5 測定法：調(diào)整儀器各項(xiàng)指標(biāo)，使儀器各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到測定要求后，編輯測定方法、干擾方程，以及選擇各測定元素，引入在線內(nèi)標(biāo)，觀察內(nèi)標(biāo)靈敏度，調(diào)節(jié)P/A 因子。符合要求后，將試劑空白、標(biāo)準(zhǔn)系列、樣品溶液分別引入儀器，由計(jì)算機(jī)采集并記錄汞及其他金屬元素的信號強(qiáng)度。選擇各元素內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中汞等5 種金屬元素的含量。

1.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)［5］

1.2.1 試藥：孟根烏蘇炮制品，內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院提供(2012.5 炮制)，孟根烏蘇-18 味丸，來源于國家蒙藥制劑中心內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院(批號：20111024)和內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院(批號：20120916)。

1.2.2 動物ICR 小鼠，SPF 級，雌雄各半，體重18 -20g，北京維通利華公司提供，合格證號：SCXK(京)2012 -0001。以清潔級大小鼠維持飼料飼養(yǎng)，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號：京飼審(2009)06166。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，整個實(shí)驗(yàn)過程中動物自由攝食和飲水，室溫20 -22℃，相對濕度為60% ～70%，光照周期為12h，7：00 ～19：00 光照，19：00 ～7：00 黑暗，適應(yīng)環(huán)境7 天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 試藥配置：用0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC)配制成不同劑量的混懸液，分別供不同劑量組的實(shí)驗(yàn)動物使用。

1.2.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)：先選擇24 只ICR 小鼠進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，將小鼠禁食不禁水16h，隨機(jī)分成6 組，每組雌、雄各2 只。將孟根烏蘇炮制品配制成(16 號小鼠灌胃針頭可以抽取)2g·ml-1，濃度較稠，但灌胃給藥尚可，再增高濃度時藥物很難抽吸，故此濃度為最大給藥濃度。給小鼠灌胃該濃度的孟根烏蘇炮制品采用2 種體積，20ml·kg-1和40ml·kg-1，給藥1 次，劑量分別為40g·kg-1和80g·kg-1。每天觀察記錄小鼠一般狀態(tài)，即進(jìn)食量、體重、毛色、活動及大小便情況，連續(xù)觀察14 天。14 天后解剖小鼠，觀察主要臟器異常變化，對觀察期間死亡動物進(jìn)行尸檢。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，如無測出半數(shù)致死量(LD50)，測定最大耐受量。

1.2.5 最大耐受量測定實(shí)驗(yàn)將120 只ICR 小鼠按體重隨機(jī)分6 組，孟根烏蘇炮制品組和對照組，孟根烏蘇-18 味丸(2 個批號)組和對照組，各組均有雌、雄小鼠10 只。試驗(yàn)前小鼠先禁食16h，不禁水。孟根烏蘇炮制品可配制的最大濃度為2g·ml-1，按小鼠體重灌胃給予孟根烏蘇炮制品混懸液1 次，給藥體積為40ml·kg-1體重，給藥劑量為80g·kg-1。孟根烏蘇-18 味丸可配制的最大濃度為0.5g·ml-1，按小鼠體重灌胃給予孟根烏蘇-18 味丸混懸液2次，間隔5h 給藥。給藥體積為40ml·kg-1體重，給藥劑量為40g·kg-1。對照組灌胃給予同體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉。給藥后連續(xù)觀察動物的反應(yīng)情況，包括一般表現(xiàn)、呼吸、行為、活動及有無驚厥等;毒性癥狀發(fā)生的時間、持續(xù)時間、恢復(fù)情況;逐日記錄動物死亡數(shù)。死亡動物進(jìn)行大體解剖，觀察各主要臟器情況。存活動物于試驗(yàn)期間每日稱體重。觀察至給藥后14 天。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±S 表示，采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn);P＜0.05 為差異有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 種金屬元素含量測定結(jié)果：采用ICP-OES 法測定了18 份來自不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠的孟根烏蘇-18 味丸，以及1 份簡化方中的5 種金屬元素的含量，其中Hg、Fe、Ca 的含量較高，但差別較大，未檢測到Pb。結(jié)果見表1 和圖1 -4。

表1 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠孟根烏蘇-18 味丸樣品中5 種金屬元素的測定結(jié)果

圖1 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠孟根烏蘇-18 味丸樣品中Hg 含量對比

圖2 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠孟根烏蘇-18 味丸樣品中Fe 含量對比

圖3 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠孟根烏蘇-18 味丸樣品中Ca 含量對比

圖4 不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)和藥廠孟根烏蘇-18 味丸樣品中Cu 含量對比

2.2 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 整體觀察

部分動物灌胃后30 分鐘出現(xiàn)腹脹現(xiàn)象，大概過8 -12h 后慢慢減輕;灌胃當(dāng)天食欲減退;眼睛有神、對來人警覺;體毛光滑;肛門有糞漬;未見傷痕，行動無異常。

2.2.2 解剖觀察

14 天觀察期結(jié)束后，對存活的動物進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察各主要臟器沒有明顯病變。

2.2.3 體重變化

孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20120916)雄性小鼠體重與對照組相比，第2、3、4 天顯著降低(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果變化見表2 和見圖5 -7。

表2 各劑量給藥組小鼠體重(g)

組別雌性給藥前 第1 天 第2 天 第3 天 第4天9 21.90 ±1.20孟根烏蘇炮制品組 19.90 ±1.20 20.90 ±1.29 22.80 ±1.81 22.50 ±1.78 22.50 ±1.35對照組 21.11 ±1.21 23.31 ±1.61 23.48 ±1.52 24.48 ±1.41 24.41 ±1.28孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20111024) 21.40 ±0.81 23.22 ±1.52 23.40 ±1.69 24.42 ±1.98 24.22 ±1.40對照組 19.30 ±1.64 21.50 ±1.78 22.00 ±1.05 22.40 ±1.26 22.40 ±1.26孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20120916) 18.90 ±0.88 20.60 ±1.17 21.30 ±1.34 21.40 ±1.3對照組 19.20 ±1.32 21.30 ±1.64 21.50 ±2.01 21.90 ±1.2 5 21.60 ±1.07組別雌性第5 天 第6 天 第7 天 第8 天 第9天3 22.80 ±1.90孟根烏蘇炮制品組 22.75 ±0.98 23.00 ±1.70 23.40 ±1.52 23.35 ±1.25 23.10 ±1.15對照組 23.93 ±1.43 24.79 ±1.38 24.40 ±1.62 24.81 ±1.45 25.01 ±1.67孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20111024) 24.39 ±1.08 24.70 ±1.64 24.58 ±1.97 25.24 ±1.96 25.37 ±1.80對照組 22.50 ±1.18 22.40 ±1.07 22.70 ±1.06 23.00 ±1.15 23.10 ±1.37孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20120916) 21.90 ±1.10 22.30 ±1.34 22.50 ±1.43 22.80 ±1.4對照組 22.50 ±1.53 22.50 ±1.72 22.95 ±1.94 22.80 ±1.8 0 22.90 ±1.45組別雌性第10 天 第11 天 第12 天 第13 天 第14天5 23.31 ±1.82孟根烏蘇炮制品組 23.87 ±1.14 23.78 ±1.35 23.60 ±1.77 23.98 ±1.34 23.95 ±1.08對照組 24.77 ±1.73 24.57 ±1.36 24.85 ±1.55 25.43 ±1.72 25.97 ±1.50孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20111024) 25.28 ±1.90 24.93 ±1.88 25.09 ±2.22 25.71 ±2.00 26.04 ±1.56對照組 23.40 ±1.07 23.30 ±1.16 23.70 ±1.49 24.00 ±1.15 24.30 ±1.46孟根烏蘇-18 味丸組(批號：20120916) 23.50 ±1.90 24.00 ±1.63 23.70 ±1.34 23.60 ±1.4對照組 23.79 ±2.05 23.26 ±1.82 23.18 ±1.91 23.70 ±1.7 3 23.85 ±1.67

圖5 孟根烏蘇炮制品急性毒性小鼠體重變化比較圖

圖6 孟根烏蘇-18 味丸(20111024)急性毒性小鼠體重變化比較圖

圖7 孟根烏蘇-18 味丸(20120916)急性毒性小鼠體重變化比較圖

2.2.4 孟根烏蘇炮制品和孟根烏蘇-18 味丸的最大耐受量：孟根烏蘇炮制品可配制的最大濃度為2g·ml-1，按小鼠體重灌胃給予孟根烏蘇炮制品混懸液1 次，給藥體積為40ml·kg-1體重，給藥劑量為80g·kg-1。孟根烏蘇-18 味丸可配制的最大濃度為0.5g·ml-1，按小鼠體重灌胃給予孟根烏蘇-18 味丸混懸液2 次，間隔5h 給藥。給藥體積為40ml·kg-1體重，給藥劑量為40g·kg-1，約為成人(60kg)日劑量的1090 倍(為大鼠與人按照體表面積折算后的倍數(shù)，1984 版內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)記載的孟根烏蘇-18 味丸用量為1.8 ～2.2g/人/日，按照最大劑量計(jì)算，60kg 人1日內(nèi)用量為0.0367g 生藥/kg)。14 天觀察期結(jié)束后，對存活的動物進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察各主要臟器無明顯病變。最大耐受量結(jié)果見表3。

表3 孟根烏蘇炮制品和孟根烏蘇-18 味丸最大耐受量

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用ICP - OES 法測定孟根烏蘇-18 味丸中Hg、Fe、Ca、Cu、Pb 等5 種金屬元素含量，測定結(jié)果表明，不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)孟根烏蘇-18 味丸樣品中Hg、Fe、Ca 的含量較高，但差別較大，未檢測到Pb。其所含的金屬元素中，F(xiàn)e 和Ca 為對人體有益的金屬元素，如Fe 及其配合物具有明顯的抗菌消炎作用，Ca 對細(xì)胞功能的維持、酶的活性及激素分泌等都有重要作用，而參與多種酶的合成［6］。這些提示了該復(fù)方中所含金屬元素在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮多種酶類作用，改變不同酶的含量及活性，從而發(fā)揮藥效作用［7］。

孟根烏蘇-18 味丸中君藥為孟根烏蘇炮制品，其主要成分為HgS，入藥的炮制品基本以熱制法炮制為主［8，9，10］。本次實(shí)驗(yàn)中，各個醫(yī)療機(jī)構(gòu)孟根烏蘇-18 味丸中Hg 含量差別較大，呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院和呼倫貝爾市蒙醫(yī)學(xué)校附屬蒙醫(yī)院樣品中Hg 的含量較高，達(dá)到了每克含4 萬μg 以上。在內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院簡化方中Hg 的含量只有126μg，這也說明了不含炮制品的樣品中Hg 的含量確實(shí)很低。此外，四子王旗醫(yī)院提供的孟根烏蘇-18 味丸中Hg的含量只有124μg，這可能說明該復(fù)方不含孟根烏蘇炮制品，在后續(xù)的研究中，利用X -射線衍射儀(XRD)檢測Hg的存在形態(tài)實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)該復(fù)方中不含HgS 類化合物。通過相關(guān)咨詢，得知該醫(yī)院未自己生產(chǎn)孟根烏蘇-18 味丸，是從藏區(qū)引進(jìn)的，故可能為藏藥十八味歐曲丸。通過本實(shí)驗(yàn)觀察到所收集的18 份孟根烏蘇-18 味丸中，Hg 的含量范圍從3554 -47571(μg/g)不等，而同一醫(yī)院國家蒙藥制劑中心內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院提供的2 個批號樣品中Hg 的含量也不一致，達(dá)到了12904 和18474(μg/g)。另額爾登桑［11］等也對國家蒙藥制劑中心內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)醫(yī)院(未寫批號)提供的孟根烏蘇-18 味丸中Hg 的含量進(jìn)行研究，結(jié)果為6385(μg/g)。這也說明了各個醫(yī)療機(jī)構(gòu)因孟根烏蘇炮制方法，以及配方等的差別原因，導(dǎo)致復(fù)方中Hg、Fe、Ca 等金屬元素含量差別較大，需在今后的醫(yī)療實(shí)踐中，規(guī)范孟根烏蘇的炮制方法。

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孟根烏蘇炮制品和孟根烏蘇-18 味丸均未測出LD50，孟根烏蘇炮制品的最大耐受量為80g·kg-1。孟根烏蘇-18 味丸最大耐受量為40g·kg-1，約為成人(60kg)日劑量的1090 倍。關(guān)于孟根烏蘇炮制品的最大耐受量方面，侯敏［12］等的研究結(jié)果表明，其熱制水銀的最大耐受量為2.8g·kg-1。關(guān)于孟根烏蘇-18味丸的最大耐受量方面，本研究團(tuán)隊(duì)的包勒朝魯［13］等的研究結(jié)果為40g·kg-1。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差別與孟根烏蘇的炮制方法，所受試藥物的批次不同，以及每個實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)技術(shù)等有關(guān)。

孟根烏蘇-18 味丸中Hg 的含量較高，其體內(nèi)蓄積靶器官以及毒性如何等有待進(jìn)一步深入研究。

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