齊旺梅 烏 蘭 蔡 碩 關(guān)寶柱 金 鳳 畢力格 白玉華*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065)

腹瀉對人和動物引起腸道正常菌群失調(diào)，吸收障礙，營養(yǎng)狀態(tài)和免疫功能降低。小兒反復(fù)腹瀉易演變?yōu)闋I養(yǎng)不良、佝僂病、貧血、慢驚風(fēng)等多種慢性疾病［1，2，5］。小兒腹瀉蒙醫(yī)分為寒熱兩型病。熱瀉是由于熱、銳性外因致小兒三根失調(diào)，齊蘇和希拉之熱偏盛下注腸腑而引起。臨床上對小兒腹瀉采取辨證分型的基礎(chǔ)上進(jìn)行治療［3］。

蒙藥蘇龍嘎-4 湯為止瀉作用顯著的傳統(tǒng)湯劑，由連翹、拳參、木通、麥冬組成。引自《內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)》和《蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗(yàn)方》，主治大小腸熱、腸刺痛、熱瀉的傳統(tǒng)方劑［4］。臨床實(shí)驗(yàn)證明蘇龍嘎-4 湯以清熱，抑希拉，木通清腑之熱，拳參解毒和止瀉，對大小腸熱癥有特效［5］。還有對傷寒、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用［6］。

目前臨床上常用蘇龍嘎-4 湯治療嬰幼兒腹瀉病［5，6］，治療豬腸熱痢疾及傳染性胃腸炎和藏獒犬細(xì)小病毒感染等［7，8］。動物實(shí)驗(yàn)證明，蘇龍嘎- 4 湯對腸道菌群有影響［9］。腹瀉與小腸黏膜上皮細(xì)胞的移動及杯狀細(xì)胞有相關(guān)性，蘇龍嘎-4 湯的止瀉作用可能與小腸黏膜上皮細(xì)胞的移動及杯狀細(xì)胞有關(guān)。本文采用番瀉葉誘導(dǎo)幼鼠腹瀉模型［10］，用細(xì)胞標(biāo)識劑BrdU 標(biāo)識合成期細(xì)胞移動位置，用PAS 染色觀察杯狀細(xì)胞數(shù)量觀察蘇龍嘎-4 湯的干預(yù)作用。

1 材料

3 ～4wk 齡wistar 幼鼠25 只，體重64 ±11g(內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物繁殖中心購入)，在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲水，保持溫度20 ±2℃，濕度50～55%，光照早8：00 到晚11：00。蘇龍嘎-4、番瀉葉購于內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院。

2 方法

2.1 腹瀉模型建立：分為空白組、腹瀉模型對照組、蘇龍嘎-4 湯低、中和高劑量組，每組各5 只。取0.6g/mL 濃度的番瀉葉，連續(xù)3d 灌胃2.5mL/Kg。造模d4，灌胃番瀉葉煎劑2h 后分別灌胃蘇龍嘎-4 湯0.04g/mL(低劑量)，0.06g/mL(中劑量)和0.08g/mL(高劑量)蘇龍嘎-4 湯溶液各2.5mL/Kg(體重)，治療4d;模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)2.5mL/kg(體重)。

2.2 取材與切片：對所有幼鼠腹腔內(nèi)注射細(xì)胞標(biāo)識劑BrdU 溶液5mL/kg(體重)，18h 后在麻醉狀態(tài)下解剖小鼠，取出十二指腸，空腸和回腸的中段部位。用4%多聚甲醛固定24h 以上。

將組織修塊為0.5 ～1cm，用5%至20%梯度蔗糖浸泡，液氮中速凍，用冰凍切片機(jī)切成4μm。

2.3 免疫組化：將冰凍切片用PBS 緩沖液(含0.05%Tween-20 的pH7.4 的磷酸鹽緩沖液)浸泡10min，3 次。為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性染色，在甲醇和0.5%過氧化氫浸泡各30min。蒸餾水洗凈后，0.5 鹽酸溶液處理15min，PBS 洗凈后用50 倍稀釋的犢牛正常血清封閉，室溫下反應(yīng)1h，用100 倍稀釋的抗BrdU 小鼠IgG(一次血清)，在4℃反應(yīng)18 ～24h。用PBS 清洗后，加50 倍稀釋的小鼠IgG 抗大鼠(二次血清)，反應(yīng)1h 后用PBS 清洗，用50 倍稀釋的小鼠PAP，反應(yīng)1h，PBS 清洗后，加0.5%DAB 顯色液，顯微鏡下觀察細(xì)胞核染成棕色或黑褐色(如細(xì)胞核以外被染色視為非特異性染色)為終止反應(yīng)，蒸餾水洗凈，蘇木精對比染色后進(jìn)行脫水，透明，封片。

2.4 PAS 染色法：將冰凍切片蒸餾水洗，過碘酸酒精液10min，自來水沖洗，Schiff 氏酒精液避光處理10min，亞硫酸水涮洗15min，流水沖洗。用邁耶蘇木精染核1s，流水沖洗，脫水、透明、封固。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紫紅色，細(xì)胞核藍(lán)色為PAS 陽性。

2.5 組織學(xué)定量法：稀便等級：根據(jù)稀便在濾紙上形成污跡面積的直徑分為一級(1cm 以下)、二級(1 ～1.9cm)、三級(2 ～3cm)和四級(大于3cm)。

2.6 腸絨毛，腸隱窩和BrdU 陽性上皮細(xì)胞的位置：從腸隱窩最底部上皮細(xì)胞到腸隱窩開口部上皮細(xì)胞的距離為腸隱窩長度;從腸隱窩開口部上皮細(xì)胞到腸絨毛最頂部上皮細(xì)胞的距離為腸絨毛長度。從腸隱窩最底部上皮細(xì)胞到腸絨毛BrdU 陽性上皮細(xì)胞的最領(lǐng)先細(xì)胞的距離為BrdU 陽性上皮細(xì)胞的移動位置。各組5 個(gè)幼鼠的小腸各部位組織中任選20 個(gè)腸隱窩和腸絨毛測量。

2.7 杯狀細(xì)胞數(shù)量：由于個(gè)體差異腸絨毛長短不同，腸絨毛上皮細(xì)胞的數(shù)量也有所不同。為了比較各部位同一個(gè)位置中存在的杯狀細(xì)胞數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了從腸絨毛根部往上200um 距離之內(nèi)存在的杯狀細(xì)胞數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 對腹瀉模型幼鼠：用番瀉葉灌胃建立腹瀉模型幼鼠效果顯著。番瀉葉灌胃1h 后出現(xiàn)稀便，3 ～5h 稀便程度最高，6h 候后稀便數(shù)量逐漸減少(圖1)。

3.2 小腸黏膜組織學(xué)定量結(jié)果：在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，幼鼠小腸黏膜沒有明顯的皺褶，有指狀腸絨毛和管狀的腸隱窩。幼鼠小腸腸絨毛從十二指腸到回腸逐漸變短。腸隱窩各部位間沒有顯著差異。但在十二指腸和空腸，腹瀉組的腸絨毛比空白組短，治療組的腸絨毛比腹瀉組長(圖2，3);腸隱窩在腹瀉組比空白組變長，在治療組比腹瀉組長(圖4，5)。在回腸、腸絨毛和腸隱窩長度在腹瀉組和治療組與空白組沒有顯著差異(圖6，7)。

圖3

圖5

圖7

3.3 BrdU 陽性腸絨毛上皮細(xì)胞的移動：BrdU 腹腔注射后在腸隱窩增殖細(xì)胞的合成期細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞標(biāo)識劑BrdU。用單克隆抗體檢出BrdU 陽性上皮細(xì)胞，測量其最領(lǐng)先細(xì)胞的位置為該上皮細(xì)胞的18h 候內(nèi)腸絨毛上移動的距離。與空白組比較，腹瀉和治療組BrdU 陽性上皮細(xì)胞的位置在十二指腸和空腸逐漸增加，尤其在高劑量組顯著增加(圖8，9)。在回腸沒有顯著差異(圖10)。

圖8

圖9

圖10

3.4 杯狀細(xì)胞的數(shù)量：與空白組比較杯狀細(xì)胞的數(shù)量在腹瀉組減少，在治療組比腹瀉組增加，整體看在高劑量組增加的數(shù)量比低中劑量明顯多(圖11，12，13)。

圖11

圖12

圖13

4 討論

番瀉葉誘導(dǎo)幼鼠腹瀉是常用方法，番瀉葉為刺激性瀉藥，通過腸黏膜和神經(jīng)從刺激腸蠕動，番瀉甙在小腸部分被吸收，后經(jīng)血流或膽汁進(jìn)入大腸，而主要?jiǎng)t由小腸直接進(jìn)入大腸，在腸內(nèi)細(xì)菌作用下經(jīng)水解、還原等變化成為大黃酸蒽酮或大黃酸蒽酮-8 -葡萄糖甙。番瀉甙可阻止葡萄糖和Na 的跨腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。本次研究表明，幼鼠腹瀉后十二指腸和空腸腸絨毛明顯變短，表明番瀉葉在小腸的近段影響較大，加快腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，導(dǎo)致腸絨毛變短。但在回腸影響不明顯是也許在小腸近段被消化吸收的較快，對回腸的刺激較小。腸隱窩在腹瀉組有所增加是為了補(bǔ)充脫落的上皮細(xì)胞，機(jī)體調(diào)節(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞的增殖和分化。蘇龍嘎-4 湯治療后腸絨毛和腸隱窩均變大的結(jié)果表明，蘇龍嘎-4 湯對腹瀉幼鼠的腸上皮細(xì)胞生長發(fā)育具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用。

杯狀細(xì)胞數(shù)量結(jié)果表明，腹瀉引起腸黏膜屏障被破壞，內(nèi)環(huán)境失調(diào)，黏液細(xì)胞分泌被抑制，數(shù)量減少。但蘇龍嘎-4 湯治療后，杯狀細(xì)胞明顯增加，揭示了蘇龍嘎-4 湯對杯狀細(xì)胞的分化和生長具有一定的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用。蘇龍嘎-4 湯促進(jìn)分泌黏液的杯狀細(xì)胞的分泌功能，改善腸道內(nèi)環(huán)境，修復(fù)黏膜屏障的完整性，從而起到止瀉作用。

蘇龍嘎-4 湯中、高劑量組作用效果顯著，具有明顯的量效關(guān)系，如臨床效果弱時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況提高給藥劑量，以保證療效。

［1］張琳，腹瀉患兒腸道菌群微生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，1994，16(6)：354 -355.

［2］格林其木格.蒙醫(yī)兒科學(xué)［M］.赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1988：222.

［3］吉格木德.蒙醫(yī)基礎(chǔ)理論［M］.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1984.

［4］內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳編.內(nèi)蒙古蒙成藥標(biāo)準(zhǔn)［M］.赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1984：12.

［5］紅梅.蒙醫(yī)治療70 例嬰幼兒腹瀉臨床觀察［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2000，(3)：18.

［6］鋼巴特爾，圖雅.蘇龍嘎-4 湯、掃日勞-4 湯、永瓦-4湯抑菌作用的對比研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2005，(1)：21 -22.

［7］謝寶昌，等.蘇龍嘎-4 湯治療豬腸熱痢疾［J］.中獸醫(yī)雜志，1992，69(4)，10.

［8］李光輝，等.蒙藥蘇龍嘎-4 湯加減治療藏獒犬細(xì)小病毒感染初探［J］.內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，23(8)，176 -178.

［9］齊旺梅，等.蘇龍嘎-4 湯對腹瀉幼鼠腸道乳酸桿菌、大腸桿菌和總需厭氧菌的影響［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2014，4(20)，47 -49.

［10］郎秀壯，丁旺.番瀉葉的研究概況［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2005 12(5)，1294.