陳良勝 方應(yīng)權(quán)

HPLC-ELSD法測(cè)定不同海拔高度桔梗皂苷的含量

陳良勝 方應(yīng)權(quán)

目的測(cè)定大別山不同海拔高度桔梗藥材的桔梗皂苷的含量, 為評(píng)價(jià)其質(zhì)量品質(zhì)提供理論依據(jù)。方法采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)法, KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫；流速0.4 ml/min。結(jié)果1000 m海拔高度以上地區(qū)桔梗藥材的皂苷含量差異性顯著, 700 m高度以下地區(qū)桔梗皂苷含量無(wú)顯著差異。結(jié)論桔梗皂苷的含量可能受陽(yáng)光、氣溫等外在因子影響而發(fā)生變化, 為有效控制桔梗藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

桔梗；海拔高度；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器； 含量測(cè)定

桔梗(Radix Platycodi)為桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.的干燥根, 在我國(guó)藥用歷史悠久, 具有宣肺、利咽、祛痰和排膿之效［1-3］。桔梗中主要成分是桔梗皂苷,現(xiàn)代藥理研究試驗(yàn)表明：桔梗中的主要活性物質(zhì)桔梗總皂苷具有廣泛的生物活性, 在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、祛痰、保肝、降膽固醇、降血脂等方面的藥理活性引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。桔梗在大別山均有種植, 氣候適宜, 病蟲(chóng)害較少, 栽培技術(shù)成熟, 地形復(fù)雜且變化多樣, 各個(gè)海拔高度都有, 從丘陵到高山, 海拔高差大, 立體氣候明顯。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法, 桔梗對(duì)照品桔梗皂苷D, 測(cè)定不同海拔高度的桔梗皂苷含量, 探索海拔高度對(duì)桔梗藥材的質(zhì)量的影響, 以期為桔梗藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠的科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 AGILENT 1100 LC 高效液相色譜儀(美國(guó))；AGILENT CHEMSTAT ION 工作站(美國(guó)安捷倫科技公司)；檢測(cè)器：AGILENT DAD；色譜柱：Phenomenex-C18柱(250 mm×4.6 mm, 粒度5 μm；迪馬公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；梅特勒ME215S十萬(wàn)分之一電子天平; 梅特勒CP224S萬(wàn)分之一電子天平；超聲波清洗儀SD3200 (昆山市超聲儀器有限公司)；LK-COOA搖擺式高速中藥粉碎機(jī)。

1.1.2 試藥 桔梗皂苷D對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所, 批號(hào)為：111851-201204, 含量94.9%)；乙腈：色譜純；甲醇,甲酸∶分析純(川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠)；超純水 (自制)。桔梗藥材樣品采自大別山區(qū)雞公山不同海拔高度,見(jiàn)表1。共12批, 同一海拔地區(qū)橫向間隔100～150 m采一次樣, 將12批樣混合均勻, 粉粹干燥至恒重備用。并經(jīng)重慶萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所方應(yīng)權(quán)教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃latycodon grandiflorμm(Jacq.)A.DC.的根。

1.2 方法［4-6］

1.2.1 色譜條件 色譜柱：KinetexC18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B), 梯度洗脫。見(jiàn)表1。流速：0.4 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定桔梗皂苷D對(duì)照品5.65 mg, 置于10 ml量瓶中, 加50%甲醇稀釋至刻度, 過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即得, 進(jìn)樣20 μl。見(jiàn)圖1。

圖1 桔梗皂苷D對(duì)照品色譜圖

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取桔梗藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)精密稱(chēng)定2 g, 置錐形瓶中, 精密加入50 %甲醇25 ml, 超聲提取30 min, 放冷, 再稱(chēng)定重量, 用50 %甲醇補(bǔ)足重量, 濾過(guò),取續(xù)濾液, 過(guò)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即得, 進(jìn)樣20 μl。見(jiàn)圖2。

圖2 桔梗藥材樣品色譜圖

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取桔梗皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品溶液 40、80、160、200、2400 μl, 置 10 ml 具塞磨口試管中,于水浴蒸發(fā)至干, 精密加10%香草醛試液 0.5 ml, 60% 硫酸 5 ml 搖勻, 于水浴加熱 15 min, 冰水浴中冷卻 3 min, 以同法平行處理的空白溶劑為空白, 在472 nm處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C (μl/ml) 為橫坐標(biāo), 吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到回歸方程為: A=0.0034 C+0.0064, r=0.9997, 結(jié)果看出C在此濃度系列范圍內(nèi)與A呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一批次桔梗樣品溶液, 按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次, 記錄指紋圖譜。計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明精密度良好。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次桔梗樣品溶液共6份,按“2.1” 項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣20 μl, 記錄指紋圖譜。計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明重復(fù)性良好。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次桔梗樣品溶液, 分別在0、2、4、6、8、12、24 h檢測(cè), 記錄指紋圖譜。計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD值, 結(jié)果顯示, RSD均<3%, 表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取已知含量的桔梗藥材已干燥粉末6份, 每份0.05 g, 加入桔梗皂苷 D 適量, 按照上述方法制備樣品溶液, 各取20 μl樣品液, 測(cè)定吸光度, 計(jì)算回收率。平均加樣回收率為96.97%, RSD為1.51%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用DAS2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果

依據(jù)方法“1.2”對(duì)不同海拔高度的12批次的桔梗皂苷含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桔梗藥材藥品來(lái)源

3 小結(jié)

海拔高度對(duì)桔梗藥材成分影響較顯著, 700 m以下地區(qū)桔梗皂苷的含量無(wú)明顯差異, 較為接近, 700 m以上地區(qū)桔梗皂苷的含量出現(xiàn)明顯變化, 說(shuō)明高海拔地區(qū)種植條件、產(chǎn)地對(duì)桔梗藥材產(chǎn)生影響。800 m以上地區(qū)陽(yáng)光、氣溫等環(huán)境因素與低海拔丘陵山地地區(qū)出現(xiàn)較為大的變化。受到其他因素影響(氣候、土壤環(huán)境、采收時(shí)間等), 為保證桔梗藥材質(zhì)量的穩(wěn)定、可靠, 建議適宜的區(qū)域化種植。而桔梗皂苷含量與外在因子的相關(guān)性研究尚需進(jìn)一步研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 259-260.

［2］李文庭, 祝明, 馬臨科, 等.桔梗的HPLC-ELSD指紋圖譜研究.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(22): 50-53.

［3］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同采收期桔梗 HPLC指紋圖譜比較研究. 中成藥, 2010, 32(3) : 353.

［4］楊海玲, 張振凌, 李俊雅, 等.河南省不同產(chǎn)區(qū)桔梗飲片 HPLC指紋圖譜研究. 河南科技, 2010(5): 66.

［5］李喜鳳, 杜云鋒, 謝新年, 等.不同產(chǎn)地桔梗藥材HPLC 指紋圖譜及桔梗皂苷D含量測(cè)定研究. 中成藥, 2010, 32(4) : 529.

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.04.183

2014-10-21］

465550 河南省新縣人民醫(yī)院(陳良勝)；重慶三峽醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校(方應(yīng)權(quán))

陳良勝