王彩霞薛 英鄧 倩張 莉魯立柱黃 炯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆烏魯木齊 830052;

2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830032)

用熒光染色法檢測BVDV最佳條件的探索

王彩霞1，2薛 英2鄧 倩2張 莉2魯立柱2黃 炯2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),新疆烏魯木齊 830052;

2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830032)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)熒光染色法檢測BVDV的最佳條件進(jìn)行了摸索,包括MDBK細(xì)胞培養(yǎng)的密度、BVDV一抗和二抗?jié)舛鹊纫蛩貙?duì)熒光染色效果的影響,獲得BVDV染色一抗稀釋度在1:150～1:200,二抗稀釋度在1:200為最佳稀釋比例,MDBK的細(xì)胞密度在104個(gè)/ml時(shí)制備的熒光染色片最優(yōu),可獲得最佳觀察效果,有利于判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

熒光染色;檢測BVDV;細(xì)胞密度;最佳條件

《2010版中華人民共和國獸藥典》規(guī)定非禽源外源病毒檢驗(yàn)中，選擇細(xì)胞培養(yǎng)被檢樣品14日后要用致細(xì)胞病變檢測、紅細(xì)胞吸附檢測、熒光抗體檢測三種方法檢測樣品中是否污染外源病毒，如檢驗(yàn)中出現(xiàn)細(xì)胞病變、紅細(xì)胞吸附、特異性熒光任意一種現(xiàn)象則判該產(chǎn)品有外源病毒污染，不合格。本實(shí)驗(yàn)是為了分析被污染樣品中是否存在BVDV而開展的，以此判斷被污染病毒的種類，從而有目的的防治外源病毒污染。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備

倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS；CO2培養(yǎng)箱：德國Hearcell；生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；100～300μl 8道微量移液器：芬蘭雷伯。

1.2 細(xì)胞

MDBK由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 病毒

BVDV（Oregon AV69）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.4 試劑與耗材

營養(yǎng)液：MEM+10%胎牛血清；維持液：MEM+2%胎牛血清；胰蛋白酶、MEM、胎牛血清由Hyclone公司提供；96孔細(xì)胞板、T25細(xì)胞瓶由BD公司提供。5mL、10mL吸管Corning公司提供。

1.5 熒光抗體

BVDV一抗由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；BVDV二抗由Jackson公司提供。

2 方法

2.1 BVDV在MDBK上繁殖

將MDBK用含10%FBS的MEM稀釋成104個(gè)/ml，105個(gè)/ml，106個(gè)/ml分別加入三塊96孔細(xì)胞板，每孔0.1ml，共加3塊細(xì)胞板，待長成單層換成維持液；將BVDV用維持液稀釋成100TCID50/ml，從第3列到第10列每孔加0.1ml毒液，其余孔每孔補(bǔ)加0.1ml維持液，三塊板相同，放入CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5日。

2.2 丙酮固定細(xì)胞板

將培養(yǎng)5日的BVDV細(xì)胞板用PBS洗三遍，晾干；用80%的丙酮固定，每孔0.05ml，2～8℃30min，甩干。

2.3 BVDV與一抗、二抗結(jié)合

將固定好的BVDV細(xì)胞板用PBS洗版3遍，晾干；將BVDV一抗用稀釋液稀釋成1：100、1：150、1：200、1：250四個(gè)稀釋度，A、B兩行加入1：100，C、D兩行加入1：150，E、F兩行加入1：200，G、H兩行加入1：250，每孔加0.05ml，每行加3～10列，在37℃濕盒中放置1h，棄液，用PBS洗版3遍，晾干；將二抗用稀釋液稀釋成1：50、1：100、1：150、1：200、1：250、1：300、1：350、1：400加入細(xì)胞板，從3～10列，每列一個(gè)稀釋度，在37℃濕盒中放置1h，棄液，用PBS洗版3遍，在熒光顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果：MDBK密度為104個(gè)/mL時(shí)，

表1 10-3個(gè)cell/mLMDBK接種BVDV間接熒光染色情況

表2 10-4個(gè)cell/mLMDBK接種BVDV間接熒光染色情況

表3 10-5個(gè)cell/mLMDBK接種BVDV間接熒光染色情況

接種BVDV最佳；BVDV染色一抗?jié)舛冉?jīng)1：150～1：200、二抗?jié)舛冉?jīng)1：200稀釋時(shí)獲得的觀察效果最佳。具體結(jié)果見表1～3和圖?！?”表示無特異性熒光斑，“+”代表有零星特異性熒光斑，觀察一段時(shí)間熒光斑消失；“++”表示有少量特異性熒光斑；“+++”表示適中熒光斑，亮度與背景能很好的區(qū)分；“++++”代表很密集的特異性熒光斑，亮度較低。

圖1 BVDV感染MDBK細(xì)胞（左）圖MDBK正常細(xì)胞（右）

3 討論

用細(xì)胞懸液鋪板時(shí)，不同的細(xì)胞濃度對(duì)染色結(jié)果有影響：細(xì)胞數(shù)量少，洗完板后會(huì)有空洞，不利于觀察；細(xì)胞數(shù)量多培養(yǎng)5天細(xì)胞會(huì)老化、圓縮。,通過實(shí)驗(yàn)我們得到本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞株中MDBK接種BVDV最佳密度為104個(gè)/mL，MDBK在細(xì)胞長成單層時(shí)接種較好。

不同品牌的熒光抗體要求的稀釋比例都不相同，而我們選擇的品牌的抗體在一抗、二抗可稀釋的濃度中，不同的稀釋度熒光染色效果也有差異：BVDV染色一抗?jié)舛葹?：150～1：200、二抗?jié)舛葹?：200時(shí)制備的熒光片觀察效果最佳。

圖1中可以看出BVDV熒光稍暗，并有閃爍著熒光的小點(diǎn)出現(xiàn)，是細(xì)胞質(zhì)染色。每種病毒的產(chǎn)生的熒光是不同的，通過熒光狀況便可判斷出是哪種病毒。（描述仔細(xì)一些——每種病毒的產(chǎn)生的熒光是不同的）

[1] 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011．

[2] 農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000．

[3] 全浩.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003．

[4] 蔣子剛，顧雪梅.分析測試中的數(shù)理統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量保證[M].上海：華東化工學(xué)院出版社，1991．