劉崇，高穎，楊洪一

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

感染辣椒輕斑駁病毒(pepper mild mottle virus，PMMoV)后，辣椒植株陸續(xù)出現(xiàn)葉片變黃、褶皺、青斑等癥狀，結(jié)果期會出現(xiàn)萎縮、斑駁等癥狀[1–4]。PMMoV 最早在美國被發(fā)現(xiàn)，其后在丹麥、日本、西班牙、加拿大、澳大利亞等國均有發(fā)現(xiàn)[1]。1994年，向本春首次在中國新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)PMMoV[2]，后來有人相繼在青島、保定、寧夏等地區(qū)發(fā)現(xiàn)了該病毒[3–4]。PMMoV 現(xiàn)已成為一種世界性病害。PMMoV 為正單鏈RNA 病毒，病毒粒子為桿狀[5]。因?yàn)镻MMoV 侵染辣椒植株的早期癥狀多不明顯，且該病毒可以通過種子、花粉、汁液摩擦等進(jìn)行傳播[6]，所以，建立病毒的快速檢測體系具有重要應(yīng)用價值。PMMoV 的常規(guī)檢測主要是采用血清學(xué)方法，國外目前已有商業(yè)化的試劑盒銷售，但試劑盒靈敏度較低，檢測結(jié)果易受葉片幼嫩程度、感病時期等因素影響[4,7–9]。利用 RT–PCR 技術(shù)檢測PMMoV 是近年來發(fā)展較迅速的方法。因?yàn)樵摲椒ㄐ枰哔|(zhì)量的辣椒總核酸，所以，整個檢測體系的技術(shù)含量較高[10]。分子雜交技術(shù)作為一種高靈敏度及高穩(wěn)定性的檢測技術(shù)曾受到廣泛關(guān)注，但放射性探針的安全性、非放射性探針的成本問題極大限制了該方法的普及。近年來，隨非放射性標(biāo)記物成本的降低，該技術(shù)已具備被大規(guī)模應(yīng)用的潛力。筆者探索PMMoV 的分子雜交技術(shù)檢測方法，以期獲得有效、快速檢測PMMoV 的技術(shù)體系。

1 材料和方法

1.1 植物材料

已感染PMMoV 的辣椒植株(表現(xiàn)為葉片黃化、果實(shí)畸形)取自吉林九臺。試驗(yàn)中的PMMoV 陰性、陽性植株分別利用DAS–ELISA、RT–PCR 進(jìn)行鑒定[10–11]；前期研究中，已獲得了陽性對照中病毒分離物的基因組全序列[10]。

1.2 RT–PCR 擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

RT–PCR 正向引物序列為ATTACTACCGCCG ATGCTGAG(5'→3')；反向引物序列為TGGAGGA AAAACACTACGAG(5'→3')。引物位于PMMoV 基因組的運(yùn)動蛋白及非編碼區(qū)[5]。引物由TaKaRa 公司合成。

以0.05g 辣椒葉片為試材，利用改進(jìn)的CTAB法分離辣椒葉片總核酸[11]。提取的總核酸最后溶于 50 μL DEPC 中。以總核酸為模板，利用RT–PCR技術(shù)擴(kuò)增PMMoV 基因組3′末端部分區(qū)域(包括部分運(yùn)動蛋白基因、外殼蛋白基因及部分非編碼區(qū))，退火溫度55℃，具體操作參見文獻(xiàn)[11]。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，與pMD18–T 載體(TaKaRa)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過PCR 鑒定陽性克隆之后進(jìn)行測序[12]。采用 BLAST 工具，在GenBank 中進(jìn)行相似性分析。

1.3 分子雜交體系的建立

利用DIG DNA 標(biāo)記試劑盒(深圳萊伯克生物技術(shù)公司)，采用PCR 技術(shù)制備cDNA 探針。反應(yīng)體系共20 μL，包括正義引物(5 μmol/L)、反義引物(5 μmol/L)各1 μL，質(zhì)粒DNA 模板200～800 ng，10×PCR Buffer 2 μL，Dig–dUTP 標(biāo)記混合物2 μL，Taq DNA 聚合酶2 U。將各組分混勻后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)退火溫度為55℃。

利用PMMoV 地高辛標(biāo)記探針，以辣椒葉片為試材，對辣椒葉片中的PMMoV 進(jìn)行分子雜交檢測。雜交檢測包括總核酸提取、預(yù)雜交、雜交、洗膜、信號檢測等步驟，按照深圳萊伯克生物技術(shù)公司的雜交試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 分子雜交體系的優(yōu)化

1.4.1 葉片干燥處理及其對雜交結(jié)果的影響

將新鮮葉片摘下后于烘箱中37℃處理24 h，之后用塑料自封袋封口存放。短期存放的(少于9 d)置于室溫下，長期存放的(超過9 d)置于4℃冰箱保存。利用改進(jìn)的CTAB 法提取干燥葉片總核酸。分別稀釋提取新鮮葉片與干燥葉片的總核酸，之后進(jìn)行點(diǎn)雜交試驗(yàn)。稀釋液為體積比5∶3∶2 的去離子水、20×SSC 和甲醛。RNA 稀釋倍數(shù)分別為10、20、40、80、160、320、640、1 000。

1.4.2 總核酸的提取及其對雜交結(jié)果影響的試驗(yàn)

取約0.05g 新鮮辣椒葉片，加入0.1 mol/L 的PBS 約1～2mL，研磨，6 000 r/min 離心10min，取上清液，加入體積比 24∶1 的氯仿、異戊醇抽提，之后用乙醇沉淀，50 μL DEPC 水溶解。

稀釋提取的總核酸后進(jìn)行點(diǎn)雜交試驗(yàn)。

1.4.3 探針特異性分析試驗(yàn)

以草莓(受草莓輕型黃邊病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)感染)、煙草(種子繁殖，未發(fā)現(xiàn)明顯病毒侵染癥狀)和蘋果(受蘋果莖痘病毒(apple stem spitting virus, ASPV)感染)為試驗(yàn)材料，進(jìn)行點(diǎn)雜交試驗(yàn)，分析探針的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMMoV 侵染辣椒的癥狀

辣椒植株被PMMoV 侵染后，感病的辣椒葉片表面出現(xiàn)凹凸不平癥狀，并出現(xiàn)大小不一的青斑，葉片有褶皺，邊緣變黃；辣椒果實(shí)較小，后期出現(xiàn)萎縮(圖1)，進(jìn)而造成減產(chǎn)。

圖1 感染PMMoV的辣椒果實(shí) Fig.1 Pepper fruit infected by PMMoV

2.2 PMMoV 特異片段的RT–PCR 擴(kuò)增及克隆測序結(jié)果

分別以經(jīng)DAS–ELISA 鑒定[10]的PMMoV 陽性、陰性對照樣品為試材，利用RT–PCR 技術(shù)在陽性對照樣品中擴(kuò)增出了預(yù)期的PMMoV 特異片段(圖2)；對此特異片段進(jìn)行克隆測序的結(jié)果表明，RT–PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為PMMoV 特異片段，大小為955 bp。BLAST 結(jié)果顯示，該特異片段序列與GenBank中PMMoV 不同分離物核苷酸序列的同源性為94%～99%。

圖2 PMMoV 特異片段RT–PCR 擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖譜 Fig.2 Electrophoretogram from the amplified specific fragment of PMMoV

2.3 利用PCR 技術(shù)制備的地高辛標(biāo)記探針

利用PCR 技術(shù)制備地高辛標(biāo)記PMMoV cDNA探針的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，探針電泳條帶清晰，整齊，大小與預(yù)期一致(圖3)。

圖3 地高辛標(biāo)記探針的瓊脂糖凝膠電泳圖譜 Fig.3 Electrophoretogram from the probe labeled with digoxigenin

2.4 分子雜交體系及其優(yōu)化結(jié)果

分別以經(jīng)DAS–ELISA、RT–PCR 鑒定[10]的PMMoV 陽性、陰性對照樣品為試材，利用地高辛標(biāo)記PMMoV cDNA 探針對辣椒樣品中的PMMoV進(jìn)行分子雜交檢測。對雜交體系進(jìn)行優(yōu)化后，最終PMMoV 陽性對照樣品可在雜交膜上顯示藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而陰性對照樣品無雜交信號。

比較以新鮮和干燥葉片為試驗(yàn)材料的檢測靈敏度，結(jié)果顯示，運(yùn)用改進(jìn)CTAB 法從干燥葉片中提取的總核酸稀釋80 倍仍可檢測到PMMoV，而從新鮮葉片中提取的總核酸稀釋640 倍后仍可有效檢測到PMMoV(圖4)，檢測靈敏度下限分別為12.5、1.6μg。

圖4 干燥和新鮮辣椒葉片總核酸不同稀釋倍數(shù)下的斑點(diǎn)雜交結(jié)果 Fig.4 Result of dot-hybridization from different dilution of total nucleic acid for dry and fresh leaves of pepper

采用快速提取法提取葉片總核酸，利用分子雜交技術(shù)可檢測到稀釋80 倍(約12.5μg 葉片)的總核酸樣品(圖5)，說明利用快速提取法提取的總核酸可以作為分子雜交的核酸樣品。盡管檢測靈敏度略低，但其操作較簡單，提取速度較快，實(shí)用性更高，其檢測靈敏度可基本滿足常規(guī)檢測試驗(yàn)的需要。

圖 5 快速提取法提取總核酸不同稀釋倍數(shù)的斑點(diǎn)雜交結(jié)果 Fig.5 Result of dot-hybridization from different dilution of total nucleic acid via rapid extraction method

對探針的特異性進(jìn)行初步分析，該探針未與測試的3 種植物病毒產(chǎn)生陽性雜交信號，說明制備的探針特異性較好。

3 結(jié)論與討論

在本研究的檢測體系中，新鮮葉片的檢測靈敏度下限約為1.6μg，與王亞南等[13]的結(jié)果相近。本研究檢測體系的檢測靈敏度總體上比血清學(xué)方法的高，比常規(guī)RT–PCR 檢測方法[13]的低，但分子雜交技術(shù)的穩(wěn)定性高于RT–PCR，操作簡單，適合大規(guī)模樣本檢測。

Sipahioglu 等[14]首次報道了高酚含量植物干燥葉片作為病毒RT–PCR 檢測材料保存的技術(shù)體系(65℃干燥2 d 后保存于4℃，可常溫運(yùn)輸)，近來也有關(guān)于通過干燥后分離茶樹、甘蔗葉片核酸的報道[15–16]。此外，在大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)保存過程中，葉片干燥后可常溫保存5～9 d[17]。Sipahioglu 等[14]的試材主要為木本植物，葉片較厚，而本研究中的辣椒為草本，葉片較薄，水分容易揮發(fā)，因而設(shè)定為37℃干燥1 d。干燥后的短期存放采取直接室溫存放，結(jié)果顯示該方法提取的核酸可有效應(yīng)用于分子雜交。推測干燥過程可能降低了葉片中一些次級代謝產(chǎn)物的量，而次級代謝產(chǎn)物嚴(yán)重干擾核酸提取。干燥后的葉片中沒有水分，保存過程中核酸相對不容易受到核酸酶的破壞，因而利于保存。盡管以干燥葉片為試材雜交檢測的靈敏度略低，但仍可作為常規(guī)檢測的試驗(yàn)材料，其優(yōu)越性在于試驗(yàn)材料的保存、處理更為方便，可長距離運(yùn)送至外地實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒檢測。

[1] Antignus Y，Lachman O，Pearlsman M，et al．A new pathotype of pepper mild mottle virus (PMMoV) overcomes the L4resistancegenotype of pepper cultivars[J]．Plant Disease，2008，92：1033–1037．

[2] 向本春，謝浩，崔星明，等．新疆辣椒輕微斑駁病毒的分離鑒定[J]．病毒學(xué)報，1994，10(3)：240–245．

[3] Wang X，Liu F，Zhou G，et al．Detection and molecular characterization of pepper mild mottle virus in China[J]. Journal of Phytopathology，2005，154(11/12)：755–757．

[4] 王亞南，趙緒生，袁文龍，等．辣椒輕斑駁病毒研究現(xiàn)狀[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(14)：7401–7402．

[5] Velasco L，Janssen D，Ruiz-Garcia L，et al．The complete nucleotide sequence and development of a differential detection assay for a pepper mild mottle virus (PMMoV) isolate that overcomes L3resistance in pepper[J]．J Virol Methods，2002，106：135–140．

[6] Colson P，Richet H，Desnues C，et al．Pepper mild mottle virus，a plant virus associated with specific immune responses，fever，abdominal pains，and pruritus in humans[J]．Plos One，2010，5(4)：e10041．doi：10.1371 /journal.pone.0010041．

[7] 郭京澤，劉鵬，崔鐵軍，等．辣椒種子中辣椒輕斑駁病毒的檢測[J]．檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2007 (6)：32–33．

[8] Ikegashira Y，Ohki T，Ichiki U T，et a1．An immunological system for the detection of pepper mild mottle virus in soil fromgreen pepper fields[J]．Plant Disease，2004，88(6)：650–656．

[9] 陳青，余芳平，林石明，等．進(jìn)境辣椒種子中檢測出辣椒輕斑駁病毒[J]．植物檢疫，2005，19(5)：295–296．

[10] 鄭敏．辣椒輕斑駁病毒的鑒定及基因組分析[D]．哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2013．

[11] 鄭敏，郭世輝，張娜娜，等．利用RT–PCR 技術(shù)檢測辣椒輕斑駁病毒的研究[J]．北方園藝，2012(24)：127–129．

[12] 李麗麗，楊洪一．草莓斑駁病毒的分子雜交檢測[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，40(3)：273–276．

[13] 王亞南，王錫鋒．辣椒輕斑駁病毒檢測方法的比較[J]．中國植保導(dǎo)刊，2008(4)：5–7．

[14] Sipahioglu H M，Usta M，Ocak M．Use of dried high-phenolic laden host leaves for virus and viroid preservation and detection by PCR methods[J]．J Virol Methods，2006，137(1)：120–124．

[15] Wongwarat T，Sakuanrungsirikul S，Theerakulpisut P. Effective methods of preserving SCWL-diseased sugarcane leaves forgenomic DNA extraction and molecular detection of phytoplasma[J]．African Journal of Biotechnology，2011，53 (10)：10871–10876．

[16] Jaiprakash M R，Pillai B，Venkatesh P，et al．RNA isolation from high-phenolic freeze-dried tea (Camellia sinensis) leaves[J]．Plant Molecular Biology Reporter， 2003，21(4)：465–466．

[17] 李華偉．大豆花葉病毒保存方法及安徽省大豆主產(chǎn)區(qū)SMV 株系動態(tài)變化的研究[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．