張文香　龐朝友　范術(shù)麗等

摘要 [目的]研究棉花中SVP類基因的功能。[方法]通過(guò)同源克隆的方法在陸地棉中棉所36中克隆SVP的同源基因GhMADS29，對(duì)其進(jìn)行Blast搜索比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析以及熒光定量的表達(dá)模式分析。[結(jié)果]GhMADS29與獼猴桃的SVP4基因相似度最高，其cDNA序列含有9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子，不同時(shí)期頂芽的熒光定量結(jié)果表明它在花芽分化起始期的花芽中表達(dá)量最高，且不同組織的熒光定量分析表明它在葉片和頂芽中表達(dá)量較高。[結(jié)論]首次獲得棉花SVP亞族基因，命名為GhMADS29，其GeneBank登錄號(hào)為JQ682642。

關(guān)鍵詞 SVP；熒光定量；開(kāi)花

中圖分類號(hào) S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-028-04

Molecular Cloning and Expression Analysis of SVPlike Gene，GhMADS29 from Gossypium hirsutum L.

ZHANG Wenxiang1，2，PANG Chaoyou1，F(xiàn)AN Shuli1，YU Shuxun1* et al

（1.Cotton Research Institute，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Anyang，Henan 455000； 2.School of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550018）

Abstract [Objective] To study SVP gene from cotton.[Method] The SVP homologue gene GhMADS29 was cloned from CCRI 36 upland cotton by homology cloning strategy.Blast alignment，phylogenetic tree and quantitative RTPCR were conducted to analyze GhMADS29.[Result] It was showed that GhMADS29 was most similar to SVP4 from kiwifruit and that GhMADS29 had nine exons and eight introns.GhMADS29 expressed highest in 2SAM （shoot apical meristems at the second true leaf expanded stage） at which stage flower bud initiated differentiation.Expression analysis in different tissues showed that GhMADS29 expressed very highly in leaves and apical buds.[Conclusion] GhMADS29 is belong to SVP subfamily obtained for the first time in cotton and the accession number is JQ682642.

Key words SVP； Quantitative RTPCR； Flowering

擬南芥中的SVP和AGL24都屬于STMADS11亞族，它們序列高度保守，在花器官分生組織決定方面具有相同的功能，但在控制開(kāi)花時(shí)間的功能上卻是相反的：AGL24是開(kāi)花促進(jìn)因子[1-2]，而SVP卻是開(kāi)花抑制因子[3]。svp突變體通過(guò)縮短營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段促進(jìn)了開(kāi)花[3]，研究表明SVP是開(kāi)花溫度途徑中一個(gè)很重要的調(diào)節(jié)因子，它會(huì)調(diào)節(jié)開(kāi)花促進(jìn)因子miRNA172在不同溫度的表達(dá)水平[4]。水稻的STMADS11亞族基因OsMADS55在野生型擬南芥中過(guò)表達(dá)后，會(huì)使擬南芥開(kāi)花時(shí)間推遲，花發(fā)育也發(fā)生改變，而另一該亞族的基因OsMADS22在擬南芥中過(guò)表達(dá)后，卻不會(huì)影響開(kāi)花時(shí)間，只是花器官發(fā)生變異。但這2個(gè)基因都不能回復(fù)svp和agl24突變體的表型[5]。

短季棉是指生育期較短的陸地棉品種，是隨著生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)種植制度的變化，與一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件、生產(chǎn)發(fā)展水平、科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平相適應(yīng)逐步形成發(fā)展起來(lái)的[6]。棉花的早熟性與多個(gè)農(nóng)藝性狀有關(guān)，如株高、第一果枝節(jié)位、苗期、蕾期、花期、鈴期、開(kāi)花縱間隔期、橫間隔期等[7]，而且隨著科學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，分子育種成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，因此筆者根據(jù)其他作物中已有功能驗(yàn)證的且確定具有調(diào)控開(kāi)花時(shí)間功能的MADS基因，確定SVP類基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以期能夠明確這些基因的功能，從而為短季棉培育提供良好的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。以棉花早熟品種中棉所36為試驗(yàn)材料，種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所老所部試驗(yàn)田，按大田常規(guī)管理辦法進(jìn)行管理。分別取子葉展平（OSAM）、第一真葉展平（1SAM）、第二真葉展平（2SAM）、第三真葉展平（3SAM）時(shí)的頂芽，以及盛花期的頂芽、根、莖、葉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、開(kāi)花后10 d的胚珠和纖維。所取材料立即投入液氮中冷凍，然后于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根公司，農(nóng)桿菌LBA4404為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所早熟課題組保存；培養(yǎng)基中的酵母粉、蛋白胨和瓊脂粉購(gòu)自O(shè)xoid公司；pGEMT easy克隆載體購(gòu)自Promega公司，常規(guī)生化試劑，如Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等，均購(gòu)自大連寶生物工程公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生物技術(shù)有限公司；膠回收及DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要儀器。PCR儀、電泳儀、超凈工作臺(tái)、紫外凝膠成像系統(tǒng)、DU800核酸蛋白分析儀、自動(dòng)蒸汽消毒鍋、超低溫冰箱、高速冷凍離心機(jī)、冷凍臺(tái)式離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 棉花RNA的提取。按照北京天根公司的RNA提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與基因克隆。以擬南芥SVP和AGL24基因?yàn)閰⒖夹蛄校珺last搜索棉花的EST數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI棉花 EST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/？term=cottonTIGR棉花 EST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址：http：//compbio.dfci.harvard.edu/cgibin/tgi/cat_download.pl？db=cottest），將得到的EST進(jìn)行拼接，得到含有完整閱讀框的cDNA序列，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物，引物需包含完整的開(kāi)放閱讀框（ORF），引物序列：29F：5′ ACCTCACTTCTTCACACTTTCTTCC3′，29R：5′ TCTTCGCAACATCACCGCCTTTTAACC3′。

根據(jù)大連寶生物公司Taq DNA聚合酶說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系，總體積為25.00 μl， 其中ExTaq酶0.15 μl，10×ExTaq Buffer 2.50 μl，10 mmol/L dNTP mixture 2.00 μl，引物（20 μmol/L）各1.00 μl，模板2.00 μl。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 4 min；95 ℃變性 45 s，54 ℃退火 40 s，72 ℃延伸50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，以天根公司的MarkerIII為參照，若條帶大小與預(yù)期結(jié)果相近，則回收目的片段，送金唯智公司測(cè)序。

1.2.3 熒光定量PCR。參照Roche公司的FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒說(shuō)明書(shū)和ABI （Applied Biosystems）公司的ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行。以GhACTIN （GenBank：AY305733）作為內(nèi)參，以控制誤差。熒光定量引物序列：Q29F：5′GCATCGACAGATCGGTCACCAG3′；Q29R：5′CGTCTCAAGCCTCCTTCAACTA3′。actinF：5′ATCCTCCGTCTTGACCTTG3′；actinR：5′ TGTCCGTCAGGCAACTCAT3′。

PCR反應(yīng)體系總體積25.0 μl ，其中SYBR Green PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板 2.0 μl。反應(yīng)程序：50 ℃預(yù)變性2.0 min；95 ℃變性10 min，95 ℃退火10 s，65 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸35 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMADS29基因的獲得

利用擬南芥SVP和AGL24的核酸序列Blast棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將得到的EST序列

通過(guò)CAP3在線拼接軟件進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接得到的序列設(shè)計(jì)引物，保證所設(shè)計(jì)引物跨越完整的ORF，以中棉所36的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增（圖1），回收目的條帶，連接到pGEMT Easy

載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆，送公司測(cè)序，確定序列后，將序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)JQ682642。

2.2 GhMADS29的序列分析

利用NCBI的ORF finder在線工具對(duì)其蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其編碼228個(gè)氨基酸。用預(yù)測(cè)的蛋白序列Blast NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示GhMADS29與獼猴桃的SVP4相似度最高，一致性達(dá)到60%，由此猜測(cè)GhMADS29屬于SVP亞族（STMADS11亞族）。將GhMADS29與其他一些作物的SVP類基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所預(yù)測(cè)的GhMADS29的蛋白序列在N末端比其他SVP基因都多出8個(gè)氨基酸（圖2），進(jìn)一步分析核酸序列發(fā)現(xiàn)，得到的cDNA序列中包含2個(gè)ATG起始密碼子，且兩者之間的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)。將這些序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，同樣發(fā)現(xiàn)GhMADS29屬于STMADS11亞族，但聚類關(guān)系不是很近（圖3）。

用所得到的cDNA序列Blast雷蒙德氏棉的基因組序列，分析GhMADS29的基因結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)所得到的這段cDNA序列所對(duì)應(yīng)的基因組序列含有9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子（圖4），而且第一個(gè)起始密碼子位于第一個(gè)外顯子，第二個(gè)起始密碼子位于第二個(gè)外顯子，基因組全長(zhǎng)11 466 bp。

2.3 GhMADS29的表達(dá)模式 由圖5A可知，在2SAM（第二片真葉展平）的花芽分化時(shí)期，GhMADS29的表達(dá)量最高，隨后的3SAM（第三片真葉展平）時(shí)期表達(dá)量也較高，但相比于2SAM，3SAM時(shí)期的表達(dá)量又有所下降。對(duì)GhMADS29進(jìn)行不同組織的表達(dá)模式分析（圖5B），發(fā)現(xiàn)其在葉片中的表達(dá)量最高，頂芽次之，各個(gè)花器官中的表達(dá)量都較低，只有苞片和心皮相對(duì)較高。 GA處理后的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)（圖6），GhMADS29的表達(dá)量下降。

3 結(jié)論與討論

該研究以擬南芥中的SVP和AGL24基因?yàn)閰⒖夹蛄?，Blast棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)后，通過(guò)EST拼接得到了GhMADS29的序列，與擬南芥SVP和AGL24序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GhMADS29與SVP相似性更高，由此猜測(cè)GhMADS29可能與SVP具有相似的功能。

不同時(shí)期頂芽的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GhMADS29在二葉展平時(shí)期頂芽中表達(dá)量最高，推斷它可能與花芽的起始分化有關(guān)，不同組織的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GhMADS29在葉片中的表達(dá)量最高，頂芽次之，而且對(duì)棉花進(jìn)行GA處理，也發(fā)現(xiàn)GhMADS29的表達(dá)量下降，因此猜測(cè)GhMADS29可能通過(guò)葉片和頂芽感受信號(hào)后表達(dá)量上調(diào)進(jìn)而促進(jìn)花芽分化且它可能與擬南芥SVP的作用模式相同，因?yàn)檠芯勘砻鲾M南芥SVP在葉片中與FLC形成二聚體調(diào)控SOC1和FT的表達(dá)[8]，進(jìn)而調(diào)控植物開(kāi)花，而且在感受到自主途徑、溫度途徑、GA途

徑的信號(hào)后，SVP在頂芽中的表達(dá)量下調(diào)[3，8-9]。通過(guò)不同組織的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GhMADS29在花器官中的表達(dá)量相對(duì)較低，因此猜測(cè)GhMADS29可能不參與花器官發(fā)育的調(diào)控。

該研究通過(guò)同源克隆的方法克隆到陸地棉中SVP類基因的完整開(kāi)放閱讀框，命名為GhMADS29，并提交到GeneBank獲得登錄號(hào)為JQ682642。其在第二片真葉展平時(shí)表達(dá)量最高，且GA會(huì)抑制其表達(dá)。

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