祖路皮亞·載買爾　阿曼古力·海瓦爾　吾甫爾?米吉提

摘要 [目的]篩選出對重金屬抗性較好的微藻品系，給相關(guān)研究提供基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)。[方法]利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡確定XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株荒漠微藻品系的細(xì)胞形態(tài)。在實驗室條件下測定生長曲線，同時，測定不同濃度重金屬（Hg2+、Cd2+、Pb2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素）對3株微藻品系生長的影響，并確定最佳抗性濃度。[結(jié)果]3株品系的細(xì)胞均為球形，XLDB3的細(xì)胞個體大，XLDB9和XLDB12的細(xì)胞壁很厚。3株品系的生長周期較長；它們對重金屬和抗生素均有一定的抗性，其中XLDB12對Hg2+和XLDB3對Pb2+的抗性最強(qiáng)，分別達(dá)到0.05和0.8 mmol/L，3株品系對Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L，對氨芐青霉素有很好的抗性，均達(dá)到1 000 μg/ml，XLDB3對四環(huán)素和鏈霉素的抗性最強(qiáng)，分別為60與40 μg/ml。[結(jié)論]該研究可為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 荒漠微藻；重金屬抗性；抗生素抗性

中圖分類號 S181.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-205-04

Preliminary Analysis of Heavy Metal Resistance of the Three Desert Microalgae in Yuli County of Xinjiang

ZULPIYE Zemir， AMANGVL Hewer， GHOPUR Mijit*

（College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi， Xinjiang 830046）

Abstract [Objective] To select the microalgae strains which have better resistance to heavy metals， provide test data for correlational studies. [Method] OM and TEM were used to observe the cell morphology of XLDB3，XLDB9，XLDB12. The growth curve of three different microalgae under the laboratory conditions were measured. Different concentrations of heavy metals （Hg2+， Cd2+， Pb2+） added based on the growth condition. Antibiotics （Ampicillin， Tetracycline and Streptomycin） were employed to measure its tolerant ability in that adversity， and also the best resistance concentrations were determined. [Result] Three microalgae （XLDB3， XLDB9， XLDB12） cells were spherical， and XLDB3 cell was big ， XLDB9 and XLDB12 cell walls were very thick. Three strains of microalgae growth cycle were long. They have a certain amount of resistance to heavy metals and antibiotics； XLDB12 and XLDB3 have strongest resistance to have metal mercury and lead were found in this test respectively （0.05 mmol/L for Hg2+ ，0.8 mmol/L for Pb2+ ）. Three strains of microalgae have a same resistance to have metal cadmium was found （0.05 mmol/L for Cd2+）. Expressed remarkable adaptation potential to antibiotic， with the resistant rate of ampicillin up to 1 000 μg/ml， and XLDB3 have strongest resistance to Tetracycline and Streptomycin up to 60 and 40 μg/ml respectively . [Conclusion] The study can provide reference basis for interaction of microalgae and heavy metal， as well as purification technology of desert microalgae.

Key words Desert microalgae； Heavy metal resistance； Antibiotic resistance

藻類是環(huán)境中進(jìn)化并完全適應(yīng)于生存環(huán)境的，含有葉綠素和完成含氧的光合作用的大量并多種多樣的有機(jī)體?；哪孱愂峭寥涝澹⊿oil Algae）的一個群體，主要是指生長在荒漠化地區(qū)上的微藻體[1]。藻類細(xì)胞壁分內(nèi)外兩層，外層為由纖維素、果膠質(zhì)、藻酸銨巖藻多糖和聚半乳糖硫酸酯等多層微纖絲組成的多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)層主要成分是纖維素。細(xì)胞壁上帶有一定電荷和粘性，增加了對重金屬離子的吸附能力。

目前，水污染已成為非常重要的環(huán)境問題。隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和工業(yè)生產(chǎn)的加快，重金屬在化工、有色冶煉、電鍍、印染和農(nóng)業(yè)等方面廣泛應(yīng)用[2]，重金屬的污染也逐漸嚴(yán)重。從 2009 年至今，我國已經(jīng)有 30 多起重特大重金屬污染事件，重金屬污染已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了我國人民的生活，重金屬污染必須引起我們的重視[3] 。過量的重金屬離子對生物體具有毒性作用，它們通過食物鏈進(jìn)入動物體和人體內(nèi)而引起各種疾病。這些污染物不僅直接傷害人類健康，破壞環(huán)境，而且還會給經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失。

傳統(tǒng)的重金屬水處理方法有化學(xué)沉淀法、離子交換法、電解化學(xué)法、蒸發(fā)濃縮法、膜技術(shù)和活性炭吸附工藝法等[4-5]。這些方法和技術(shù)具有效率高，時間短等優(yōu)點，但是不適合大規(guī)模利用 [6]。因此，利用簡單而自然的原料和生物資源的生物吸附作用（例如細(xì)菌、真菌、酵母、藻類等）來處理是最佳選擇。與其他生物吸附劑相比，藻類具有較強(qiáng)的吸附性能，并且來源豐富。利用藻類治理重金屬污水已為眾多的研究證明具有高效，低耗，環(huán)保的特點[7]。在此基礎(chǔ)上探索藻類對重金屬廢水的生物吸附技術(shù)已逐漸成為國際水體污染處理研究中的一個新熱點。

在土壤微藻的分離純化過程中存在著大量的不同種類的細(xì)菌，這些細(xì)菌與藻類之間存在著密切的關(guān)系，它們既可能促進(jìn)微藻的生長，也可能抑制其生長，因此藻與菌之間的關(guān)系一直是微藻研究重要課題之一。為了抑制細(xì)菌的生長而經(jīng)常使用抗生素，所以研究土壤微藻對抗生素的抗性有其特定的生物學(xué)及實用意義。

該試驗研究了重金屬（Hg2+、Pb2+、Cd2+）和抗生素（氨芐青霉素、四環(huán)素、鏈霉素）對3株微藻品系生長的影響，并對3株微藻對重金屬和抗生素的抗性進(jìn)行比較，以期為微藻和重金屬的相互作用研究及荒漠微藻的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)

試驗所用的綠囊藻（XLDB3）、Marvania（XLDB12）和小球藻（XLDB9）是新疆大學(xué)植物生物技術(shù)校級重點實驗室植物細(xì)胞研究室從新疆富蘊(yùn)縣荒漠樣本中分離純化而得到的。藻株的培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光強(qiáng)度為800～2 000 Lux，溫度為18～26 ℃，明暗周期為18 h∶8 h。在整個培養(yǎng)過程中，各操作步驟均進(jìn)行滅菌處理（120 ℃，30 min）。

1.2 試驗試劑

HgCl2、CdCl2·2.5H2O、PbCl2為國產(chǎn)藥品，用雙重水定容至0.05 mol/L母液，存于容量瓶中備用。氨芐青霉素鈉鹽和四環(huán)素鹽酸鹽分別用雙重水定容至100和10 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，鏈霉素硫酸鹽用無水乙醇定容至50 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯存-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 3種藻類生長的測定。取處于對數(shù)生長期的藻液，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞并接種新配制的BBM液體培養(yǎng)基，接種量為4.7×104個/ml，每天人工搖1～2次。每天定時取樣測定650 nm波長下的吸光值。

1.3.2 3種藻類的細(xì)胞形態(tài)觀察。處于對數(shù)生長期的藻液取1 ml加入NaN3抑制細(xì)胞的運(yùn)動，制備切片用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。制備切片[8]利用透射電鏡觀察細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.3 3種藻類的抗重金屬特性檢測。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種重金屬離子的母液（用針頭過濾器過濾），配制成的汞離子濃度分別為0.000 5、0.001 0、0.003 0、0.005 0、0.010 0 mmol/L，鉛離子的濃度分別為 0.3、0.4、05、0.6、0.8、1.0 mmol//L，鎘離子的濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mmol/L。以不加重金屬的空白組作為對照，3種藻株以4.7×104個/ml的接種量接入上述含不同濃度重金屬的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每個梯度3 個平行組，每天人工搖1～2次。每天定時取樣測定650 nm波長下的吸光值。

1.3.4 3種品系的抗生素抗性檢測。已滅菌的BBM培養(yǎng)液中分別加入3種抗生素，配成的氨芐青霉素濃度分別為40、45、50、55、60、100、250、500、1 000 μg/ml，四環(huán)素濃度分別為

2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，鏈霉素濃度分別為1、2.5、5、10、20 30、40、45、50、55、60 μg/ml，以萊茵衣野生型

品系CC124作對照。4種藻株按4.7×104個/ml接種量接入含不同濃度抗生素的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每個梯度3 個平行組。每天人工搖1～2次，觀察細(xì)胞是否生長。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析。

試驗所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行分析。用Excel作圖。

2 結(jié)果

2.1 3種藻株的生長曲線

圖1表示了XLDB3、XLDB9、XLDB12 3株品系的生長情況。從圖1可知，3株品系在第4天開始進(jìn)入對數(shù)生長期，在第10天由對數(shù)期末期轉(zhuǎn)入了衰亡期，整個生長過程中沒有出現(xiàn)穩(wěn)定期，該3株品系的生長周期較長。

圖1 3種品系的生長曲線

2.2 3株品系的細(xì)胞結(jié)構(gòu)

由圖2可知，品系XLDB3的細(xì)胞是球形，細(xì)胞體大；亞顯微結(jié)構(gòu)很特殊，細(xì)胞的核區(qū)很明顯，核區(qū)周圍可以看出淀粉粒，細(xì)胞壁不厚，沒有發(fā)達(dá)的液泡。品系XLDB9的細(xì)胞是球形，與品系XLDB3相比，細(xì)胞體很小，細(xì)胞內(nèi)有較大的液泡。該品系的細(xì)胞壁很厚，葉綠體很明顯，液泡系特別發(fā)達(dá)。品系XLDB12的細(xì)胞也是球形，與品系XLDB3相比，細(xì)胞體很小，細(xì)胞壁很厚，核區(qū)很明顯。

2.3 3株品系的重金屬抗性檢測

2.3.1 Hg2+對3株品系生長的影響。

由圖3可知，隨著時間的延長，3株微藻的吸光值不斷增加，但試驗濃度范圍內(nèi)隨著（ Hg2+）的增加，吸光值不斷降低，6 d后更明顯（P<005）。藻株XLDB3和XLDB9在5種濃度組[ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異顯著（P<005），高濃度組 [0.003 mmol/L≤ρ（Hg2+）≤0010 mmol/L] 的藻細(xì)胞生長幾乎停止，說明5種濃度的Hg2+抑制該2株品系的生長，ρ（Hg2+）≥0.005 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB3的死亡，ρ（Hg2+）≥0.003 mmol/L的Hg2+導(dǎo)致XLDB9的死亡。藻株XLDB12低濃度組[ρ（Hg2+）≤0005 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>005）；高濃度組[ρ（Hg2+）=0.010 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎停止了生長，說明ρ（Hg2+）≤0050 mmol/L的Hg2+對該品系生長的抑制不明顯，XLDB12對0.050 mmol/L的Hg2+有抗性。XLDB12對金屬Hg2+的抗性高于XLDB3和XLDB9，XLDB12對Hg2+的抗性達(dá)到0.050 mmol/L。

43卷15期 祖路皮亞·載買爾等 新疆尉犁縣3株荒漠微藻的重金屬抗性初步分析

2.3.2 Pb2+對3種藻株生長的影響。

由圖4可知，Pb2+對3種微藻生長的影響與Hg2+不相同。XLDB3在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對照組，4 d后高濃度組[ρ（Pb2+）=1.0 mmol/L]的吸光值不斷降低，藻細(xì)胞幾乎死亡，說明ρ（Pb2+）≤0.8 mmol/L的Pb2+促進(jìn)XLDB3的生長，1.0 mmol/L 的Pb2+導(dǎo)致該品系的死亡，因此，XLDB3對Pb2+抗性達(dá)到0.8 mmol/L。前4 d內(nèi)XLDB9和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），都高于對照組，4 d后XLDB9高濃度組[ρ（Pb2+）>0.4 mmol/L]的吸光值和XLDB12在5種濃度組[ρ（Pb2+）≤1.0 mmol/L] 的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細(xì)胞幾乎死亡，說明前4 d內(nèi)5種濃度的Pb2+促進(jìn)XLDB9和XLDB12的生長，4 d后0.3和0.4 mmol/L濃度下XLDB9的藻細(xì)胞仍然生長，其他濃度組的生長受到抑制，而XLDB12在5種濃度的生長都受強(qiáng)烈的抑制，最后都死亡。因此，XLDB9對Pb2+抗性達(dá)到0.4 mmol/L。XLDB3

2.3.3 Cd2+對3種藻株生長的影響。

由圖5可知，前4 d內(nèi)XLDB3和XLDB12在5種濃度組的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），4 d后該2株藻高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的吸光值不斷降低（P<0.05），第6天藻細(xì)胞幾乎死亡，說明前4 d內(nèi)5種濃度的Cd2+對該2種品系生長的影響不明顯，4 d后高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞生長受到抑制，到第6天細(xì)胞死亡，因此，XLDB3和XLDB12對Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L。在10 d內(nèi)，XLDB9低濃度組[ρ（Cd2+）≤0.05 mmol/L]的吸光值與對照組相比差異不顯著（P>0.05），而高濃度組[ρ（Cd2+）≥010 mmol/L] 的吸光值與對照組相比差異顯著（P<0.05），第4天高濃度組[ρ（Cd2+）≥0.10 mmol/L]的藻細(xì)胞幾乎死亡，說明高濃度組的Cd2+強(qiáng)烈抑制該品系的生長，XLDB9對Cd2+的抗性也達(dá)到0.05 mmol/L。3株品系對Cd2+的抗性均達(dá)到0.05 mmol/L，其中XLDB3的抗性較強(qiáng)。

2.4 3株品系的抗生素抗性檢測

2.4.1 氨芐青霉素對4株品系生長的影響。

從表1可知，氨芐青霉素濃度為40～1 000 μg/ml時，4株品系都能正常生長，它們對氨芐青霉素的抗性均達(dá)到1 000 μg/ml，其中XLDB12的抗性最強(qiáng)。

2.4.2 四環(huán)素對4株品系生長的影響。

從表2可知，四環(huán)素濃度為2.5～60 μg/ml時，XLDB3和對照CC124在最高濃度中正常生長，而XLDB9和XLDB12能生長的最高濃度是40 μg/ml。因此，該4株品系中CC124對四環(huán)素的抗性較強(qiáng)，已達(dá)到60 μg/ml。

2.4.3 鏈霉素對4株品系生長的影響。

從表3可知，鏈霉素濃度為1～60 μg/ml時，對照CC124和XLDB3能生長的最高鏈霉素濃度為40 μg/ml，而XLDB9和XLDB12只能生長在1和2.5 μg/ml濃度中。該4株品系之中CC124對鏈霉素的抗性較強(qiáng)，已達(dá)到40 μg/ml。

3 結(jié)論與討論

通過該試驗可知，3株微藻對Hg2+和Pb2+的抗性存在較大的差別，它們對Hg2+的抗性大小順序為XLDB12>XLDB3>XLDB9，對Pb2+的抗性大小順序為XLDB3>XLDB9>XLDB12，對Cd2+的抗性基本一致。試驗中發(fā)現(xiàn)，氨芐青霉素對3株微藻品系和對照CC124的生長均沒有明顯的影響，當(dāng)氨芐青霉素濃度在40～1 000 μg/ml之間變化時，4株品系均具有抗性，抗性大小順序為XLDB12> XLDB9> CC124> XLDB3。四環(huán)素對XLDB3和對照CC124生長的影響不明顯，該兩株品系對四環(huán)素均具有抗性，而四環(huán)素對XLDB9和XLDB12生長的影響較明顯，當(dāng)濃度為2.5～40 μg/ml時，該2株微藻均有較弱的抗性，濃度到45 μg/ml時細(xì)胞就死亡，它們的抗性大小順序為CC124> XLDB3> XLDB12 > XLDB9。鏈霉素對4株品系生長的影響很明顯，當(dāng)濃度為1～40 μg/ml時，XLDB3和CC124均有較強(qiáng)的抗性，濃度到45 μg/ml時細(xì)胞死亡，而鏈霉素濃度為5 μg/ml時，XLDB9和XLDB12都死亡，它們的抗性大小順序為CC124> XLDB3>XLDB9> XLDB12。

由于藻類細(xì)胞表面具有與重金屬離子結(jié)合的帶負(fù)電荷的官能團(tuán)，使其在藻細(xì)胞的表面和內(nèi)部沉積，因此，抑制藻類生長的主要原因被認(rèn)為是重金屬離子與藻類的親和性，并且親和性越強(qiáng)毒性越大[9]。藻細(xì)胞可以有效降低重金屬離子對本身的脅迫作用，但隨著重金屬濃度的增加和脅迫時間的延長，微藻的正常生理功能受到嚴(yán)重傷害，從而逐漸喪失了對脅迫的調(diào)節(jié)能力[10]。

抗生素對藻細(xì)胞的作用是多方面的，抗生素對藻體本身有直接的作用，既可能抑制藻類的生長，又可能在特定濃度時刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧在低濃度范圍內(nèi)的增多，從而促進(jìn)微藻的生長。不同抗生素的作用機(jī)理是各不相同的。

參考文獻(xiàn)

[1] 謝作明.荒漠藻類對紫外輻射的響應(yīng)及其結(jié)皮形成的研究[D].武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所，2006.

[2] 孟樣和，胡國飛.重金屬廢水處理[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：5-11，14-15，17-50.

[3] 李愷，耿存珍，張陽，等.活性和非活性海藻吸附重金屬的研究[J].環(huán)境工程，2013，31（1）：51.

[4] 張劍波，馮金敏.離子吸附技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用和發(fā)展[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2000，1（1）：46-51.

[5] 趙璇，吳天寶，葉裕才.我國飲用水源的重金屬污染及治理技術(shù)深化問題[J].給水排水，1998，24（10）：22-25.

[6] 王璐.電吸附法去除水中重金屬離子的研究[D].西安：西安建筑科技大學(xué)，2010.

[7] VOLESKY B，SCHIEWER S.Encylopedia of bioprocess engineering[M].New York：Flickinger M C，1999：433-453.

[8] 董志芳，艾山江·阿布都拉，阿布力孜·阿布力米提，等.屬離子抗性衣藻品系的分離篩選及其鑒定[J].武漢植物學(xué)研究，2010，28（1）：21-26.

[9] FISHER N S.On the reactivity of metals form marine phytoplankton[J]. Limnology and Oceanography，1986，31（2）：443-449.

[10] 王帥，梁英，田傳遠(yuǎn).Cd2+脅迫對6株微藻生長及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慬J].海洋湖沼通報，2009（3）：56-66.