宋嬌　楊燁　喻小瓊等

摘要

[目的]建立肌衛(wèi)星細(xì)胞和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的共培養(yǎng)體系。[方法]用10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX對(duì)北京油雞肌肉SV細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后，通過(guò)油紅染色法、細(xì)胞免疫學(xué)鑒定及關(guān)鍵基因的表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)的SV細(xì)胞進(jìn)行分析。[結(jié)果]油紅O脂肪染色法鑒定結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的細(xì)胞紅色脂質(zhì)密度較高，說(shuō)明SV細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后含有更多的前體脂肪細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)細(xì)胞發(fā)育的標(biāo)志性基因，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的肌肉SV細(xì)胞均會(huì)表達(dá)前體脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因。[結(jié)論]肌肉SV細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后前體脂肪細(xì)胞的含量得到提高，有利于建立前體脂肪細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。

關(guān)鍵詞 北京油雞；前體脂肪細(xì)胞；肌衛(wèi)星細(xì)胞；共培養(yǎng)體系；誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào) S831.8+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）15-151-03

Study on the Adipogenic Differentiation of SV Cells in Skeletal Muscles of Beijing You Chicken

SONG Jiao1， YANG Ye1*， YU Xiaoqiong2 et al

（1. College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025； 2. State Key Laboratory of Animal Nutrition， Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

Abstract [Objective] This research aimed to establish the cocultures system of muscle satellite cells and intramuscular preadipocytes. [Method] The SV cells in the muscles of Beijing You Chicken were induced with 10 μg/ml insulin （INS）， 1 μmol/L dexamethasone （DEX） and 115 ng/ml 3isobutyl1methyl xanthine （IBMX）. And the induced SV cells were identified by oil red O staining， cellular immunological identification and the expression of key genes involved in adipogenesis and myogenesis. [Result] The results of oil red O staining showed that the induced SV cells contained higherdensity red stained lipid， which indicated that the induced SV cells contained more preadipocytes. The key genes about the cell development were detected by realtime fluorescent quantitive PCR. The detection results showed that the key genes of preadipocytes could be expressed by induced and noninduced SV cells in the muscles. [Conclusion] The induced muscle SV cells contained more preadipocytes， which was be propitious to establish the coculture system in vitro of muscle satellite cells and preadipocytes.

Key words Beijing You Chicken； Preadipocyte； Muscle satellite cell； Coculture system； Induction

肌內(nèi)前體脂肪是肌衛(wèi)星細(xì)胞的重要組成部分之一，肌衛(wèi)星細(xì)胞在特定的分子機(jī)制（如PPARs信號(hào)系統(tǒng)、WNT信號(hào)系統(tǒng)和肌肉分泌因子）作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞[1]。由于受到肌肉和脂肪內(nèi)分泌素（myokines、adipokines）相互作用的影響，肌內(nèi)脂肪細(xì)胞可能與脂肪組織里脂肪細(xì)胞具有不同的生物學(xué)代謝過(guò)程[2]。在共培養(yǎng)體系中，肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的代謝都與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的代謝具有一定的差異[3]。因此，建立合適的共培養(yǎng)體系能更好地闡明細(xì)胞間相互聯(lián)系的復(fù)雜性，是研究肌內(nèi)脂肪沉積和肌肉發(fā)育的生物學(xué)基礎(chǔ)。

來(lái)源于肌肉的SV細(xì)胞具有類(lèi)似于肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化特性，同時(shí)也具有一些脂肪細(xì)胞的特性，是一種建立理想細(xì)胞共培養(yǎng)體系的細(xì)胞來(lái)源，但由于受到細(xì)胞貼壁時(shí)間的影響，在分離的肌肉SV細(xì)胞內(nèi)含有的前體脂肪細(xì)胞很少[4]，同時(shí)受到肌細(xì)胞分泌素（myokines）的影響，前體脂肪細(xì)胞的分化會(huì)受到嚴(yán)重抑制[5]?；诖?，筆者在前期分離肌肉SV細(xì)胞的基礎(chǔ)上，使用一定的脂肪生成誘導(dǎo)劑對(duì)肌肉SV細(xì)胞的脂肪生成能力進(jìn)行誘導(dǎo)，以使肌肉SV細(xì)胞中的前體脂肪細(xì)胞更好地分化表達(dá)，從而建立一種理想的細(xì)胞培養(yǎng)模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM、DMEM/F12、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均為Gibco公司產(chǎn)品；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、地塞米松（Dex）、胰島素（Ins）、3異丁基1甲基黃嘌呤（IBMX）均為Sigma公司產(chǎn)品。Pax7鼠抗雞一抗、Demsin鼠抗雞一抗、FITC羊抗鼠二抗均為Abcam公司產(chǎn)品。

1.2 肌肉基質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采用窒息法將4～7日齡北京油雞殺死后，放入75%（v/v）酒精溶液中全身浸泡消毒30 s，于細(xì)胞室超菌臺(tái)進(jìn)行分離細(xì)胞工作。取胸大肌后迅速放入含有雙抗的DHanks溶液中清洗3次，剪成肉糜狀，移入10 ml離心管中，再加入2倍體積的0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶，于37 ℃搖床中消化30～40 min，1 000 r/min離心8 min，棄上清。然后，再加2倍體積的0.25%的胰蛋白酶，37 ℃搖床中消化15～20 min；此后，加入2～3倍體積的DMEM培養(yǎng)基中止消化，用吸管反復(fù)吹打使組織分散，將細(xì)胞懸浮液依次濾過(guò)200、400和600目的不銹鋼篩，收集濾液。將過(guò)濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 ml含15%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)板在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，將細(xì)胞懸浮液接種于其他培養(yǎng)板，獲得肌肉SV細(xì)胞。

1.3 肌肉SV細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后脂質(zhì)含量的測(cè)定

分離細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于6板96孔板，每孔接種100 μl，每板接種18孔，其中誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)各9孔，誘導(dǎo)組在細(xì)胞貼壁后使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)24、48、72 h后進(jìn)行細(xì)胞脂質(zhì)含量。其中3板分別在誘導(dǎo)24、48、72 h后采用油紅O染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，另外3板在上述時(shí)間采用MTT法測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。以單位細(xì)胞數(shù)的OD值反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

1.4 肌肉SV細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定

將分離的基質(zhì)細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于6孔板，每孔2 ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，細(xì)胞分為未誘導(dǎo)組（對(duì)照組）和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/LDEX和115 ng/ml IBMX的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)48 h后2個(gè)處理同時(shí)采用油紅O染色法進(jìn)行前體脂肪細(xì)胞的鑒定。

1.5 肌肉SV細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后基因表達(dá)的測(cè)定

將分離到的基質(zhì)細(xì)胞按1×105個(gè)/ml接種于6孔板，每孔2 ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)6 d后，將細(xì)胞分為未誘導(dǎo)組（對(duì)照組）和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組使用含有10 μg/ml INS、1 μmol/L DEX和115 ng/ml IBMX的培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)24、48 h后分別收集2組的細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取6孔（6個(gè)重復(fù)），對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞特異性基因（Pax7、MyoD、Myogenin）和脂肪細(xì)胞發(fā)育特異性基因（C/EBPβ、SREBP2、PPARγ、LPL）的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析?；蛞锛靶蛄刑?hào)見(jiàn)表1。通過(guò)2 -ΔΔCt 值來(lái)衡量誘導(dǎo)對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量的影響[6]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序?qū)Σ煌T導(dǎo)時(shí)間細(xì)胞的基因相對(duì)表達(dá)量的差異進(jìn)行分析，差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉SV細(xì)胞脂質(zhì)含量 從圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，肌肉SV細(xì)胞脂質(zhì)的含量逐漸增加，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，脂質(zhì)含量明顯增加。

2.2 細(xì)胞的鑒定 前體脂肪細(xì)胞油紅O染色結(jié)果表明，誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組細(xì)胞都有紅色脂質(zhì)沉積，其中誘導(dǎo)后的細(xì)胞紅色脂質(zhì)密度較高（圖2），說(shuō)明誘導(dǎo)有助于前體脂肪細(xì)胞的分化。

2.3 細(xì)胞關(guān)鍵基因表達(dá)的分析

從圖3可以看出，前體脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)24 h后C/EBPβ和LPL基因的表達(dá)水平顯著

下降（P<0.05），而誘導(dǎo)48 h后又顯著上升（P<0.05）；

3 討論

肌肉SV細(xì)胞中含有豐富的前體脂肪細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞，是建立前體脂肪細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞共培養(yǎng)體系理想的細(xì)胞來(lái)源[4]。由于這2種細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同，從肌肉SV細(xì)胞分離到的肌衛(wèi)星細(xì)胞中含有的前體脂肪細(xì)胞數(shù)量很少，肌衛(wèi)星細(xì)胞在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但肌衛(wèi)星細(xì)胞作為具有多種自我更新的異質(zhì)干細(xì)胞群，同時(shí)也具有肌衛(wèi)星細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的潛力，在特定細(xì)胞因子的作用下（如PPARs、WNT生長(zhǎng)因子、myokines等），肌衛(wèi)星細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞并沉積脂肪，同時(shí)伴隨著脂肪細(xì)胞特異性基因（如PPARγ）的表達(dá)[1]。

在多細(xì)胞培養(yǎng)體系中，DEX（地塞米松）和胰島素（INS）一般都用于促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和脂肪的形成[7]。前體脂肪細(xì)胞在激素（胰島素和類(lèi)固醇激素）的作用下啟動(dòng)C/EBPβ和C/EBPδ的表達(dá)，從而促進(jìn)一系列脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[8]。C/EBPβ和C/EBPδ是脂肪形成早期表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)C/EBPβ和C/EBPδ的協(xié)同作用可以促進(jìn)PPARγ的表達(dá)[9]。甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）是前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志，SREBP在體內(nèi)通過(guò)PPARγ途徑調(diào)節(jié)許多與脂肪生成有關(guān)的基因的表達(dá)，如LPL和FAS等。PPARγ是脂肪開(kāi)始生成轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志性蛋白，是脂肪形成所必需的轉(zhuǎn)錄因子[8]。SV細(xì)胞在激素誘導(dǎo)下，PPARγ、C/EBPβ和SREBP的表達(dá)量都會(huì)增加，說(shuō)明SV細(xì)胞

中前體脂肪細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生了變化，并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增

加，基因的表達(dá)會(huì)有所增加。

肌肉內(nèi)脂肪的代謝途徑是肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞相互作用的結(jié)果，肌內(nèi)脂肪與肌肉的比例不僅是評(píng)價(jià)動(dòng)物肉品質(zhì)非常重要的指標(biāo)，也是影響動(dòng)物健康的重要因素[1]。因此，建立合適的肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，不僅可以

研究肌內(nèi)脂肪的沉積和肌細(xì)胞發(fā)育機(jī)制，從而改善動(dòng)物肌肉

品質(zhì)，更重要的是可以研究二者的相互調(diào)控對(duì)動(dòng)物健康的影響，促進(jìn)動(dòng)物福利的改善。該研究只提供了這2種細(xì)胞共培養(yǎng)的初步模型，今后還需要對(duì)這2種細(xì)胞的精確調(diào)控發(fā)育進(jìn)行進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] VETTOR R，MILAN G，F(xiàn)RANZIN C，et al.The origin of intermuscular adipose tissue and its pathophysiological implications[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297：987-998.

[2] SELL H，DIETZESCHROEDER D，ECKEL J.The adipocytemyocyte axis in insulin resistance[J].TRENDS in Endocrinology and Metabolism，2006，17（10）：416-422.

[3] VU V，KIM W，F(xiàn)ANG X，et al.Coculture with primary visceral rat adipocytes from control but not streptozotocininduced diabetic animals increases glucose uptake in rat skeletal muscle cells：Role of adiponectin[J].Endocrinology，2007，148：4411-4419.

[4] HAUSMAN G J，POULOS S P.A method to establish cocultures of myotubes and preadipocytes from collagenase digested neonatal pig semitendinosus muscles[J].J Anim Sci，2005，83：1010-1016.

[5] QUINN L S，ANDERSON B G，STRAITBODEY L，et al.Oversecretion of interleukin15 from skeletal muscle reduces adiposity[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，296：191-202.

[6] LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2 -ΔΔCT method[J].Methods，2001，25：402-408.

[7] POULOS S P，DODSON M V，HOUSMAN G J.Cell line models for differentiation：preadipocytes and adipocytes[J].Experimental Biology and Medicine，2010，235：1185-1193.

[8] TONTONOZ1 P，SPIEGELMAN B M.Fat and beyond：The diverse biology of PPARγ[J].Annu Rev Biochem，2008，77：289-312.

[9] LEFTEROVA M I，LAZAR MA.New developments in adipogenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2009，20：107-114.