胡舉偉，張會(huì)慧，孫廣玉*

(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

Prxs是通過其所具有的半胱氨酸殘基(–Cys)清除生物生理過程產(chǎn)生的活性氧的一類蛋白[1–2]，不含結(jié)合金屬離子輔基，存在于多種生物中[3–4]。植物葉綠體中，目前發(fā)現(xiàn)只有一種Prxs，即2–Cys Prx，它由核基因編碼[5–6]，2–Cys Prx與葉綠體中的類囊體膜相結(jié)合，具有較高的保守性[7–8]。

植物在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧可破壞細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，葉綠體內(nèi)的活性氧可對(duì)光合機(jī)構(gòu)造成破壞，2–Cys Prx可能在降低活性氧對(duì)光合機(jī)構(gòu)的損傷中發(fā)揮重要作用[9]，從而在非生物脅迫導(dǎo)致APX 活性下降時(shí)，清除葉綠體內(nèi)的H2O2[10]。2–Cys Prx清除活性氧自由基主要依賴于硫氧還蛋白為電子受體而發(fā)揮作用，2–Cys Prx也可發(fā)生可逆性氧化失活來調(diào)節(jié)H2O2濃度[11]。非生物脅迫條件可促進(jìn)2–Cys Prx基因的表達(dá)[12]，另外，2–Cys Prx還可以通過十聚體的形式，發(fā)揮分子伴侶的功能[13–14]，參與植物體內(nèi)多種與氧化相關(guān)的生理病理過程，且十聚體具有較高的活性[15–16]。2–Cys Prx基因表達(dá)水平的提高有助于增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的耐受能力[17–18]。筆者分別以過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草(Nicotiana tabacum)龍江911為試驗(yàn)材料，比較了2–Cys Prx基因過表達(dá)和抑制表達(dá)煙草的生長(zhǎng)特性和葉片光合功能，擬為進(jìn)一步揭示2–Cys Prx基因的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草(龍江911)，其陽(yáng)性植株由東北林業(yè)大學(xué)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過反轉(zhuǎn)錄克隆出2–Cys Prx基因，分別構(gòu)建了過表達(dá)和抑制表達(dá)載體，通過電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，利用農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化煙草而獲得[19]。過表達(dá)2–Cys Prx基因煙草陽(yáng)性植株記為過表達(dá)Prx，抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草陽(yáng)性植株記為抑制表達(dá)Prx。

1.2 方法

試驗(yàn)于2014年03—06月在東北林業(yè)大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。過表達(dá)Prx 和抑制表達(dá)Prx 進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根后移栽到培養(yǎng)缽中，以混合的草炭土、蛭石(體積比2∶1)為培養(yǎng)基，每缽定植1 株。移栽后，初期用保鮮膜覆蓋2 d，待其緩苗后將培養(yǎng)缽置于光照為200 μmol/m2·s，每天照光12 h，黑暗12 h，溫度控制在25～30℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用非轉(zhuǎn)基因煙草作為對(duì)照(CK)。待植株長(zhǎng)至10片葉時(shí)，進(jìn)行生長(zhǎng)特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

生長(zhǎng)特性包括煙苗株高、根系長(zhǎng)度、地上部和地下部的鮮重及干重。每個(gè)處理重復(fù)5次。

利用便攜式脈沖調(diào)制熒光儀(英國(guó) FMS–2 (Hansatch 公司出品)，測(cè)定充分光適應(yīng)后的幼苗倒數(shù)第2 片功能葉片的開放PSⅡ反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率(Fv'/Fm')、電子傳遞速率(ETR)，暗適應(yīng)30min 后測(cè)定PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

選取幼苗倒數(shù)第2 片功能葉片，暗適應(yīng)30min，利用Mini 調(diào)制式掌上葉綠素?zé)晒鈨x(捷克FluorPen FP 100 max)測(cè)定其OJIP 曲線，將OJIP 曲線按Vt=(Ft–Fo)/(Fm–Fo)公式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，參照Strasser等[20]的方法計(jì)算相關(guān)參數(shù)。測(cè)定時(shí)避開葉脈，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

利用Excel 2003和DPS 7.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析、最小顯著差異法比較不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的生長(zhǎng)特性

由表1 可以看出，過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的株高和根長(zhǎng)分別高于CK24.45%(P＜0.01)和40.38% (P＜0.01)，差異均極顯著。抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的長(zhǎng)勢(shì)與CK 差異較小，但整體長(zhǎng)勢(shì)弱于CK，其株高和根長(zhǎng)分別低于CK 15.09%(P＞0.05)和12.45%(P＞0.05)，與CK 差異均不顯著。過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的葉片數(shù)與CK 均無顯著差異。過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草植株的地上部鮮重、地下部鮮重、總鮮重、地上部干重、地下部干重和總干重均大于CK，抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草的最低，且不同處理之間各指標(biāo)均達(dá)極顯著差異水平(P＜0.01)。

表1 煙草植株的生長(zhǎng)性狀 Table 1 Growth characteristics of tobacco seedlings

2.2 過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由表2 可以看出，過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的Fv/Fm均維持在0.8 以上，不同處理之間無顯著差異。過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Fv'/Fm'與CK 間沒有顯著差異，而ETR 則較CK 增加了9.86%(P＞0.05)，但未達(dá)顯著差異水平。抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Fv'/Fm'和ETR分別低于CK 7.00%(P＜0.05)和35.96%(P＜0.01)。

圖2 煙草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fig.2 Chlorophyll fluorescemce parameters in leaves of tobacco seedlings

2.3 過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的OJIP 曲線

由圖1 可以看出，過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的OJIP 曲線形態(tài)明顯不同于CK，其中過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片OJIP曲線上各點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度Ft均較CK 有所增加，且過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的增加幅度更大，另外，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理之間的差異幅度增大。將OJIP 曲線標(biāo)準(zhǔn)化后可以看出，不同處理之間煙草葉片OJIP 曲線上各點(diǎn)的相對(duì)可變熒光Vt之間差異變得較小，而大約在J 點(diǎn)和I 點(diǎn)不同處理之間表現(xiàn)出明顯的差異，不同處理煙草葉片的VI較CK 均有不同程度的增加。

圖1 過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的OJIP 曲線和標(biāo)準(zhǔn)化OJIP 曲線 Fig.1 Chlorophyll a fluorescemce tramsient (OJIP) and normalized OJIP for leaves of tobacco seedlings with 2–Cys Prx overexpressed and suppressed

2.4 過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雷達(dá)圖

由圖2 可以看出，過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Area 和Ψo分別較CK 有不同程度的增加，而抑制表達(dá)處理則呈明顯的降低趨勢(shì)。過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的φEo和ETo/RC 較CK 分別增加了6.93%和4.24%，而φDo和DIo/RC 則較CK 分別降低了5.49%和6.82%，抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的φEo和ETo/RC 較CK 分別降低了7.26%和7.24%，而φDo和DIo/RC 則較CK 分別增加了3.42%和3.30%。過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的ABS/RC和TRo/RC 均沒有發(fā)生明顯變化。

圖2 煙草葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)雷達(dá)圖 Fig.2 Radar plot of fluorescence data in leaves of tobacco seedlings

3 討論

過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的生長(zhǎng)優(yōu)于CK，表現(xiàn)為株高和根長(zhǎng)明顯高于CK，并且地上部和地下部鮮重和干重也明顯高于CK，而抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草生長(zhǎng)受到抑制。不同處理煙草植株的葉片數(shù)沒有明顯差異，即過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草生長(zhǎng)的區(qū)別主要表現(xiàn)為植株葉片面積的增加或降低，而并沒有明顯促進(jìn)新生葉片的發(fā)生，但是，株高的變化卻說明過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草的節(jié)間距相對(duì)增加。

沒有經(jīng)受環(huán)境脅迫并經(jīng)過充分暗適應(yīng)的植物葉片的Fv/Fm是比較恒定的，基本不存在物種間的差異[21]。本試驗(yàn)中，過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的Fv/Fm與CK 沒有明顯差異，均維持在0.8 以上，說明在沒有其他環(huán)境脅迫條件下并沒有引起煙草葉片發(fā)生光抑制現(xiàn)象。雖然過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Fv'/Fm'較CK 沒有明顯增加，但過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的ETR 較CK明顯增加，并且抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Fv'/Fm'和ETR 也較CK 明顯降低，表明過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的光能轉(zhuǎn)化和電子傳遞情況不同，特別是抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的電子傳遞能力明顯降低。

不同處理下煙草葉片的OJIP 曲線形態(tài)明顯不同，但由于原始的OJIP 曲線受外界環(huán)境的影響較大，因而，在數(shù)據(jù)處理中常常將OJIP 曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[22]。不同處理下標(biāo)準(zhǔn)化OJIP 曲線在J 點(diǎn)和I點(diǎn)出現(xiàn)明顯差異，OJIP 曲線上J 點(diǎn)熒光變化反映了PSⅡ電子受體側(cè)QA向QB的電子傳遞特征[23]，結(jié)合表2 可以發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片電子傳遞的差別主要體現(xiàn)在PSⅡ受體側(cè)。過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Area 和Ψo均較CK 明顯增加，而抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的Area 和Ψo均呈明顯的降低趨勢(shì)，即過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的PSⅡ電子受體庫(kù)(QA、QB和PQ庫(kù)等)以及PSⅡ反應(yīng)中心的活性相對(duì)高于抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草[24]，這也說明過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片受體側(cè)電子傳遞速率增加或降低的原因與PSⅡ受體側(cè)電子受體庫(kù)大小的改變具有直接的關(guān)系。過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx基因煙草葉片的光能分配和利用情況存在區(qū)別，雖然過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的ABS/RC和TRo/RC與CK相比均沒有發(fā)生明顯變化，但過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的φEo和ETo/RC較CK 明顯增加，而φDo和DIo/RC 則明顯降低，說明過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片吸收的光能更傾向于分配到光化學(xué)反應(yīng)，而以無效熱能形式耗散的能量比例降低，這有利于光反應(yīng)同化力的供應(yīng)，以維持正常的碳同化。而抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片吸收光能用于光化學(xué)反應(yīng)的比例相對(duì)降低。

綜上所述，過表達(dá)和抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的PSⅡ光化學(xué)活性無明顯差異，但過表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草葉片的PSⅡ光合電子傳遞能力相對(duì)高于抑制表達(dá)2–Cys Prx 基因煙草，這主要與其PSⅡ電子受體側(cè)接受電子能力的增強(qiáng)有關(guān)，而抑制2–Cys Prx 基因煙草葉片的電子傳遞能力和光能分配到光化學(xué)反應(yīng)的比例相對(duì)降低，以無效熱能形式的耗散比例相對(duì)增加。

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