仇桂玲　鄧銀燕

摘 要 禽流感血凝抑制試驗(yàn)中，建立雞紅細(xì)胞吸附鴨血清非特異性凝集因子方法，分別對(duì)雞紅細(xì)胞懸液與鴨血清吸附處理的取液量配比、吸附時(shí)間以及雞紅細(xì)胞濃度進(jìn)行探討。在確定取液量配比、及吸附時(shí)間后，通過(guò)對(duì)同一批鴨血清樣品分別經(jīng)不同濃度的雞紅細(xì)胞懸液吸附處理后進(jìn)行一系列對(duì)比試驗(yàn)，找出雞紅細(xì)胞懸液吸附處理鴨血清中非特異性凝集因子的最佳濃度。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，采用在96孔90?微孔板中逐孔加入0.05 mL待檢血清和0.05 mL20%雞紅細(xì)胞懸液吸附1 h以上能夠獲得理想效果。

關(guān)鍵詞 禽流感抗體；非特異性凝集因子；雞紅細(xì)胞吸附；鴨血清

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）15-00-02

目前，在采用雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)鴨血清中禽流感抗體時(shí)，常常存在非特異性凝集現(xiàn)象，導(dǎo)致在結(jié)果判定時(shí)，雞紅細(xì)胞不流淌或流淌不完全，給結(jié)果判定造成嚴(yán)重干擾。鑒于實(shí)驗(yàn)室的條件限制，難以采集鴨紅細(xì)胞進(jìn)行同源血清抗體檢測(cè)，普遍采用雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測(cè)。禽流感血凝抑制試驗(yàn)中雞紅細(xì)胞吸附鴨血清非特異性凝集因子方法的建立分別對(duì)雞紅細(xì)胞懸液與樣品血清吸附處理的取液量配比、吸附時(shí)間以及雞紅細(xì)胞濃度進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

抗原：禽流感病毒H5亞型（re-6）血凝抑制試驗(yàn)抗原，哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。血清：20份新鮮鴨血清。

1.2 儀器用品

96孔90?V型微孔板和BIOHIT可調(diào)移液器。

1.3 方法

1.3.1 紅細(xì)胞懸液制備

1%、5%、10%、20%雞紅細(xì)胞懸液。1%雞紅細(xì)胞懸液按GB/T18936-2003方法制備。5%、10%、20%雞紅細(xì)胞懸液分別按照0.5、1、2 mL雞紅細(xì)胞原液溶于10 mLPBS制得。雞紅細(xì)胞原液在最后一次洗滌離心后去掉上清液后制得。

1.3.2 血凝抑制試驗(yàn)

按照GB/T18936-2003[1]。

1.3.3 雞紅細(xì)胞懸液與樣品血清吸附處理的取液量及配比的確定

因本法采用在微孔板中逐孔加入待檢血清和雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行吸附，為確保吸附處理后的樣品上清液大于血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)樣品量0.025 mL，并且不稀釋樣品致影響樣品抗體效價(jià)測(cè)定，故以1∶1配比吸附；同時(shí)，加入微孔中的液體總量不至于溢出，本法采用0.05 mL雞紅細(xì)胞吸附0.05 mL鴨血清。

1.3.4 吸附時(shí)間的確定

參考GB/T18936-2003中HA及HI試驗(yàn)中抗原抗體吸附時(shí)間在30～40 min，為保證雞紅細(xì)胞對(duì)鴨血清非特異性凝集因子的最大限度的吸附及完全沉淀出上清液，本法吸附時(shí)間采用60 min。

1.3.5 用于吸附的雞紅細(xì)胞懸液濃度的研究

雞紅細(xì)胞懸液吸附預(yù)處理及分組試驗(yàn)。為了尋求雞紅細(xì)胞懸液吸附處理鴨血清中非特異性凝集因子的最佳濃度，選取5%、10%、20%，30%雞紅細(xì)胞吸附預(yù)處理后進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以比較其檢測(cè)效價(jià)和判定效果。在微孔板中進(jìn)行吸附處理，加貼膜覆蓋以防揮發(fā)，輕震后靜置1 h，吸取0.025 mL上清進(jìn)行檢測(cè)。

按以下5個(gè)分組進(jìn)行鴨血清禽流感H5亞型抗體效價(jià)檢測(cè)，用1%雞紅細(xì)胞懸液對(duì)20份直接測(cè)定為7log2的不同鴨血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)抗凝集效果統(tǒng)計(jì)。A組：直接測(cè)定；B組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 5%雞紅細(xì)胞懸液吸附后測(cè)定；C組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 10%雞紅細(xì)胞懸液吸附后測(cè)定；D組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 20%雞紅細(xì)胞懸液吸附后測(cè)定；E組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 30%雞紅細(xì)胞懸液吸附后測(cè)定。

2 結(jié)果

4種測(cè)定方法凝集現(xiàn)象去除效果對(duì)比見(jiàn)表1；5種測(cè)定方法血清效價(jià)具體結(jié)果見(jiàn)表2（效價(jià)單位為L(zhǎng)og2）。

表1中，凝集數(shù)A：僅1～2孔出現(xiàn)凝集的份數(shù)；凝集數(shù)B：2孔以后出現(xiàn)凝集的份數(shù)；不凝集數(shù)：不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的份數(shù)；凝集率B：凝集數(shù)B/30，其下降可反映去除兩孔以后非特異性凝集因子的效果[2]；去除凝集率：不凝集數(shù)/30，其上升可反映完全去除非特異性凝集因子的效果。表2中，將B、C、D方法分別和A法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明B、C、D法測(cè)得的效價(jià)與A法差異不顯著（P）。

3 討論

從表1結(jié)果來(lái)看，鴨血清經(jīng)10%、20%、30%雞紅細(xì)胞吸附處理后，非特異性凝集率（總凝集率）由A法的100%下降至C、D法的95%、75%、75%，表明雞紅細(xì)胞吸附法能明顯去除非特異性凝集因子。 經(jīng)10%、20%、30%雞紅細(xì)胞吸附處理后，2孔以后的非特異性凝集率（凝集率B）由A法的95%下降至C、D、E法的30%、25%、25%，表明.10%.20%雞紅細(xì)胞吸附在去除2孔以后的凝集現(xiàn)象效果均明顯；去除凝集率由C法5%上升到30%、25%，可見(jiàn)20%、30%雞紅細(xì)胞吸附處理比10%雞紅細(xì)胞吸附更能去除2孔以內(nèi)的非特異性凝集因子甚至完全去除單個(gè)樣品的凝集現(xiàn)象，從表2結(jié)果來(lái)看，鴨血清中非特異性凝集因子會(huì)使抗體效價(jià)出現(xiàn)1～2個(gè)滴度的誤差，因此有必要去除。

4 小結(jié)

試驗(yàn)表明30%、20%、10%雞紅細(xì)胞懸液吸附處理比5%雞紅細(xì)胞懸液吸附處理，更明顯降低血清中非特異凝集的影響，10%及以上濃度雞紅細(xì)胞懸液即可對(duì)鴨血清中非特異性凝集因子明顯去除，20%、30%雞紅細(xì)胞懸液吸附在去除非特異性凝集上整體效果相當(dāng)。出于便于雞紅細(xì)胞懸液制備的考慮，采用較低雞紅細(xì)胞濃度，即20%雞紅細(xì)胞懸液應(yīng)用于日常檢測(cè)進(jìn)行對(duì)鴨血清廢特異性凝集因子的去除。

參考文獻(xiàn)

[1]GB/T18936-2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[2]鄧波，李凱航，薛霞，等.禽流感血凝抑制試驗(yàn)中鴨血清非特異性凝集因子去除方法的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：39-41.

（責(zé)任編輯：劉昀）