廉宜君，陳韓英，李炳奇，谷新利*

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院；3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院）

奶牛復(fù)方促孕灌注液的安全性和穩(wěn)定性試驗研究

廉宜君1，陳韓英2，李炳奇1，谷新利3*

（1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院；3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院）

為了解奶牛復(fù)方促孕灌注液的安全性和穩(wěn)定性，采用急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗對促孕灌注液進行安全性評價，并采用強光照射試驗、高濕度試驗、加速試驗和室溫留樣觀察試驗考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，制備的灌注液屬無毒、無刺激藥物，并且穩(wěn)定性良好。

促孕灌注液；安全性；穩(wěn)定性

石河子大學(xué)動物科技學(xué)院針對奶牛不孕現(xiàn)狀，研制開發(fā)了中藥復(fù)方“促孕散”，該方由淫羊藿、益母草等九味中藥，依辨證論治療原理配制而成，主要用于治療母畜卵巢靜止和持久黃體引起的不孕癥，臨床效果顯著[1]。以“促孕散”為基礎(chǔ)制備的灌注液，有效成分利用率高，臨床用藥量明顯減少，且操作方便。最明顯的優(yōu)勢是藥液質(zhì)量可控，改變了用藥途徑，使藥物直達(dá)患處，能直接對病癥進行治療。

藥物毒性反應(yīng)的危害是國際社會共同關(guān)注的問題。長期以來，人們普遍認(rèn)為，純中藥制劑毒性很小甚至無毒，但近年來有關(guān)中藥的不良反應(yīng)時有報道，特別是某些注射用中藥致人死亡事件的發(fā)生令人擔(dān)憂，使人們開始重新審視中藥的安全性，而對中藥及其制劑用于防治疾病時，必須進行毒性試驗，同時藥物的安全性試驗數(shù)據(jù)也是新藥審批的必備材料[2]。該灌注液為經(jīng)奶牛子宮灌注的黏膜類用藥，也必須符合黏膜類藥物的相關(guān)要求。

本研究通過采用急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗，并采用加速試驗及室溫留樣考查試驗等方法考察其安全性和穩(wěn)定性，為該制劑用于獸醫(yī)臨床治療奶牛不孕癥提供安全性和穩(wěn)定性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

奶牛復(fù)方促孕灌注液（自制），昆明種成年雌性小白鼠（石河子大學(xué)實驗動物中心提供），雌性新西蘭兔（由石河子大學(xué)實驗動物中心提供，平均體重為1.9～2.3 kg），飼養(yǎng)于恒溫（23±3）℃動物房內(nèi)，動物房通風(fēng)良好，光照12 h，濕度50%～60%，每天上、下午各排氣1次，每次30 min以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 促孕灌注液安全性檢驗

1.2.1.1 試驗前動物處理

試驗動物購回后，先預(yù)飼1周，使其適應(yīng)新環(huán)境。預(yù)飼期間，保持動物生活環(huán)境的清潔，提供充足的食物及飲水，并仔細(xì)觀察其活動情況，若發(fā)現(xiàn)有行為異常及生病情況的，應(yīng)及時挑出，以免影響試驗結(jié)果。

1.2.1.2 急性毒性試驗

取健康小白鼠30只，隨機分為3組，用藥前12 h禁食不禁水，腹腔注射量分別是：第1組0.5 mL/10 g體重，第2組0.25mL/10 g體重，第3組0.125 mL/10 g體重。同時設(shè)不給藥對照組。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，觀察3 d內(nèi)小白鼠死亡情況，計算LD50[3]。

3 d內(nèi)若有死亡，應(yīng)立即進行尸檢；試驗結(jié)束時也應(yīng)進行尸檢，觀察其內(nèi)臟器官的變化情況。

1.2.1.3 蓄積毒性試驗

取健康小白鼠30只，體重約20 g，隨機分為3組，給藥前12 h禁食不禁水，給藥量分別是：第1組0.1 mL/只，第2組0.2 mL/只，第3組0.3 mL/只。同時設(shè)不給藥對照組。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)給藥20 d，在給藥期間每天觀察小白鼠的生理狀態(tài)和活動情況（包括精神狀況和飲食狀況等）。給藥結(jié)束后再觀察1周，并剖殺尸檢，觀察其內(nèi)臟組織器官有無異常[4]。

1.2.1.4 刺激性試驗

選取正常健康家兔6只，采用同體自身對照，用藥前先觀察并記錄角膜、虹膜及結(jié)膜情況，剔除有病變或炎癥者。試驗時在左眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入0.l mL生理鹽水，右眼滴入0.1 mL的促孕灌注液，然后使其被動閉合眼睛8～10 s，觀察給予藥物1 h、24 h、48 h，72 h后眼睛的反應(yīng)情況，并按表1進行評分[5]。

表1 眼刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 促孕灌注液穩(wěn)定性檢驗

參照文獻[6]中2010年版附錄藥物穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則確立了穩(wěn)定性研究考察項目，檢測指標(biāo)為外觀與色澤、微生物限度及pH值。

1.2.2.1 強光照射試驗

將促孕灌注液放入自制木箱，接上100W白熾燈全天照射灌注液，按時取樣觀察并測定相關(guān)指標(biāo)[7]，取樣時間為：0天（當(dāng)天）、第5天、第10天。各測定項以0天為參照。

1.2.2.2 高濕度試驗

在干燥器下部放置KNO3溶液，使其達(dá)到溫度25℃，相對濕度（90±5）%的條件，再將灌注液放入干燥器內(nèi)按時取樣觀察并測定相關(guān)指標(biāo)，取樣時間為：0天（當(dāng)天）、第5天、第10天。各測定項以0天為參照。

1.2.2.3 加速試驗

將促孕灌注液在溫度（40±2）℃、相對濕度（60 ±5）%的條件下放置3個月，試驗期間每個月取樣觀察并測定相關(guān)指標(biāo)。各測定項以0天為參照。

1.2.2.4 室溫留樣觀察試驗

取促孕灌注液樣品，在室溫下放置12個月。每隔3個月取樣觀測其外觀色澤、澄清度、測定pH值。各測定項以0天為參照。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

小白鼠注射藥物后2 h內(nèi)有輕微不適，食欲減退，飲水量正常；注射藥物4～6 h，小白鼠活動恢復(fù)正常，未見任何異常反應(yīng)；7 d內(nèi)無小白鼠死亡。斷頸處死后解剖觀察小白鼠內(nèi)臟，均無異常。本試驗小白鼠注射灌注液量相當(dāng)于生藥量500 g/kg體重，LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于15 g/kg體重毒理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)。證明該促孕灌注液屬無毒類物質(zhì)。

2.2 蓄積毒性試驗結(jié)果

3組小白鼠分別按 0.1 mL/只，0.2 mL/只，0.3 mL/只給藥20 d，在給藥期間和停藥后7 d內(nèi)，小白鼠無死亡現(xiàn)象，也無異常反應(yīng)。給藥結(jié)束后再觀察1周，并剖殺稱重尸檢，各試驗組小白鼠體重與對照組無顯著性差異，觀察其內(nèi)臟組織器官均健康無異常。說明該促孕灌注液基本上無蓄積毒性。

2.3 刺激性試驗結(jié)果

在給家兔右眼滴入促孕灌注液6 h后，6只家兔出現(xiàn)不同程度的眼結(jié)膜血管充血現(xiàn)象，并有少量分泌物，無水腫癥狀，表明該灌注液具有較弱的刺激作用，而隨著時間的推移，其刺激作用越來越弱，24 h后充血現(xiàn)象逐漸減弱，48 h后充血現(xiàn)象基本消失，除個別有少量分泌物外，角膜、虹膜在滴入藥液后無任何癥狀出現(xiàn)，綜合評分為3分，按藥理學(xué)實驗標(biāo)準(zhǔn)判定為無刺激性藥物。表明該促孕灌注液是一種符合黏膜用藥的制劑。

2.4 強光照射試驗結(jié)果

促孕灌注液強光照射試驗結(jié)果見表2。由表2可知，促孕灌注液在100 W強光照射的條件下放置10 d，物理性狀沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，藥液氣味芳香，pH值基本不變。

表2 強光條件下促孕灌注液的檢測結(jié)果

2.5 高濕度條件下的試驗結(jié)果

促孕灌注液高濕度條件下的試驗結(jié)果見表3。由表3可以看出，促孕灌注液在溫度25℃，相對濕度（90±5）%的條件下，物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，無任何雜質(zhì)，氣味芳香，pH值基本不變。

表3 高濕度條件下促孕灌注液的檢測結(jié)果

2.6 加速試驗結(jié)果

促孕灌注液加速試驗結(jié)果見表4。由表4可以看出，在溫度40℃，相對濕度75%的條件下觀察5個月，從每月的取樣觀察、測定結(jié)果可知該促孕灌注液的物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，澄清無沉淀，氣味芳香，pH值基本不變。

表4 加速試驗條件下灌注液的檢測結(jié)果

2.7 室溫留樣觀察試驗結(jié)果

該灌注液經(jīng)12個月室溫留樣考察，藥液均無異常現(xiàn)象，物理性狀幾乎沒有改變，外觀仍為棕色的清亮液體，無雜質(zhì)，pH值保持在6.6～6.8，藥物穩(wěn)定，結(jié)果與加速試驗基本一致，故認(rèn)為本灌注液基本能保證藥品的質(zhì)量，因此有效期可暫定1年。

3 討論

（1）中藥毒性可以被理解為中藥不良反應(yīng)。本試驗從急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗幾個方面，對灌注液進行了安全性評價。從試驗結(jié)果可以看出，LD50遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于15.00g/kg體重，根據(jù)獸藥安全評價標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)LD50＞15g/kg體重時，藥物屬于無毒性物質(zhì)，所以該灌注液屬無毒類藥物。（2）在蓄積毒性試驗中，給小白鼠連續(xù)給藥20 d，未出現(xiàn)死亡，在停藥1周內(nèi)，小白鼠仍未出現(xiàn)死亡，證實了灌注液無蓄積毒性。給藥組小鼠在灌胃后短時間內(nèi)出現(xiàn)輕度腹瀉，糞便稀軟的現(xiàn)象，分析可能是藥物濃度較高，灌藥量較大對胃腸等器官造成較大壓迫作用，致使胃腸蠕動興奮。（3）該促孕灌注液經(jīng)奶牛子宮灌注，必須保證藥物對奶牛子宮用藥的安全性，從刺激性試驗結(jié)果可知，其符合黏膜類藥物的制劑要求，為該藥液的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。（4）從穩(wěn)定性試驗可知，促孕灌注液在100W強光照射的條件下放置10d或在相對濕度（90 ±5）%的環(huán)境中或在5個月的加速試驗期內(nèi)穩(wěn)定，該促孕灌注液的物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，澄清無沉淀，氣味芳香，pH值基本不變。該灌注液經(jīng)12個月室溫留樣考察，各項指標(biāo)均無明顯改變，藥物穩(wěn)定。有效期可暫定1年。

[1]羅瑞卿，谷新利.促孕散治療奶牛卵巢疾病引起不孕癥的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，27（4）：455-457.

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2000版）二部[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.

[4]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[5]引乾，羅延紅，蒿彩菊，等.藥理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，1998.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[7]辛蕊華，謝家聲，鄭繼方，等.射干地龍顆粒的含量測定及制劑穩(wěn)定性研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（7）：29-33.

新疆以工代賑示范工程獲中央投資1.04億元

6月2日，新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)改委在網(wǎng)站公布，近日，國家發(fā)展改革委下達(dá)了我區(qū)以工代賑示范工程2015年中央預(yù)算內(nèi)投資計劃，安排資金1.04億元，創(chuàng)近年來新高。

此次計劃主要安排在和田、喀什、克州等7個地州的英吉沙、洛浦、莎車、塔什庫爾干、尼勒克、托里、青河等21個縣。重點支持跨區(qū)域、綜合性示范效果和帶動作用強的田間水渠配套、小流域治理、草場建設(shè)、中低產(chǎn)田改造、斷頭連接路等基礎(chǔ)性工程。

以工代賑示范工程是國家在貧困地區(qū)實施的，對調(diào)整當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和增加農(nóng)牧民收入具有典型示范帶動效益的項目。自1984年至今，已是我區(qū)實施以工代賑項目第31個年頭。

（《新疆都市報》）

2015—05—06

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：谷新利，男，漢族，教授，博士，博士生導(dǎo)師。