杜昭勵，程艷飛，朱卉，何秀萍，張博潤

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絮凝基因及高表達提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能

杜昭勵1,2，程艷飛1，朱卉1,2，何秀萍1，張博潤1

1 中國科學(xué)院微生物研究所中國科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

杜昭勵, 程艷飛, 朱卉, 等. 絮凝基因FLO1及FLO1c高表達提高工業(yè)釀酒酵母乙酸耐受性及發(fā)酵性能. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(2): 231–241.Du ZL, ChengYF, Zhu H, et al. Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrial Saccharomyces cerevisiae by overexpression of flocculent gene FLO1 and FLO1c. Chin J Biotech, 2015, 31(2): 23 1–241.

乙酸是生物質(zhì)乙醇發(fā)酵過程中酵母細胞面臨的重要抑制劑之一，對細胞生長及發(fā)酵性能有強烈的抑制作用。增強酵母菌對乙酸脅迫的耐受性對提高乙醇產(chǎn)率具有重要意義。用分別帶有完整絮凝基因及其重復(fù)序列單元C發(fā)生缺失的衍生基因的重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化非絮凝型工業(yè)釀酒酵母CE6，獲得絮凝型重組酵母菌株6-AF1和6-AF1c。同時以空載體pYCPGA1轉(zhuǎn)化CE6的菌株CE6-V為對照菌株。與CE6-V相比，絮凝酵母明顯提高了對乙酸脅迫的耐受性。在0.6% (/) 乙酸脅迫下，6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為對照菌株CE6-V的1.56倍和1.62倍；在1.0% (/) 乙酸脅迫下，6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為對照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍?？梢娦跄芰Ω脑炷苊黠@提高工業(yè)釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性及發(fā)酵性能，而且內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失具有更加明顯的效果。

工業(yè)釀酒酵母，絮凝基因乙酸脅迫耐受性，發(fā)酵性能

隨著資源、能源和環(huán)境問題的日益呈現(xiàn)，以生物質(zhì)為原料通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)能源產(chǎn)品及高值化學(xué)品受到高度關(guān)注[1]。作為生物技術(shù)領(lǐng)域非常重要的微生物之一，酵母菌在生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用一直是相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的熱 點[2-3]。在生物質(zhì)原料預(yù)處理過程中產(chǎn)生的弱酸類、醛類和酚類等抑制物對細胞生長和代謝具有抑制作用。其中弱酸類化合物中的乙酸含量最高。乙酸由木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中半纖維素脫乙酰作用生成，終濃度大約在1–10 g/L[4-5]。當培養(yǎng)基的pH值低于乙酸的解離常數(shù)(pKa 4.76) 時，分子態(tài)的乙酸可通過自由擴散或水甘油通道蛋白Fps1p以及轉(zhuǎn)運蛋白Ady2p和Jen1p轉(zhuǎn)運入酵母細胞內(nèi)[6-7]，從而導(dǎo)致胞內(nèi)環(huán)境酸化及乙酸根陰離子的積累，嚴重抑制細胞的生長和代謝。因此增強酵母菌的乙酸脅迫耐受性對提高底物利用率和產(chǎn)物產(chǎn)率具有重要意義[8-9]。

酵母菌絮凝是指酵母細胞之間相互聚集形成絮狀或顆粒狀細胞團，并迅速沉降到發(fā)酵液底部的一種生理特性,絮凝的發(fā)生是一種無性的、鈣依賴的、可逆的過程。良好的絮凝特性有利于工業(yè)發(fā)酵過程中酵母細胞和發(fā)酵液的有效分離，因此對簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義[10-13]。絮凝的發(fā)生依賴于絮凝蛋白與鄰近細胞表面寡聚甘露糖鏈間的結(jié)合，是釀酒酵母中典型的絮凝蛋白編碼基因，含有大量銜接重復(fù)序列，根據(jù)其編碼氨基酸序列的一致性，這些重復(fù)序列可以劃分為A、B、C和D 4個重復(fù)單元[14]。重復(fù)序列是基因內(nèi)高度活躍的成分，通過驅(qū)動基因內(nèi)或基因間的滑移和重組，改變基因內(nèi)重復(fù)序列的數(shù)量或排列方式，從而影響絮凝蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[14-15]。分別缺失內(nèi)部重復(fù)序列單元B、C、D提高了絮凝蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性，使酵母細胞絮凝特性表現(xiàn)出對環(huán)境酸堿變化的廣泛適應(yīng)性[16-17]。經(jīng)乙醇脅迫、兩性霉素B或過氧化氫處理后，絮凝酵母的細胞存活率是非絮凝酵母的2–100倍[18]，表明絮凝也可能是細胞抵抗有害環(huán)境的一種保護機制。絮凝是否能賦予酵母菌對其他環(huán)境脅迫的耐受性，以及重復(fù)序列變化引發(fā)的絮凝特性變化是否影響酵母菌應(yīng)對環(huán)境脅迫的能力目前還不清楚。本研究將完整基因與內(nèi)重復(fù)單元C缺失的衍生基因在工業(yè)釀酒酵母中進行表達，分析比較其對工業(yè)釀酒酵母脅迫耐受性及發(fā)酵性能的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

本研究所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌保存和培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基[19]，篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子用含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基；酵母菌常規(guī)培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基[20]，篩選釀酒酵母轉(zhuǎn)化子用含500 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基，比較不同乙酸濃度下細胞生長時，將YPD培養(yǎng)基pH調(diào)到4.5；發(fā)酵培養(yǎng)基為EFM培養(yǎng)基(100 g/L葡萄糖，6 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，5 g/L尿素，1 g/L磷酸二氫鉀，15 g/L硫酸鎂，0.55 g/L無水氯化鈣)。

1.2 主要試劑和工具酶

高保真DNA聚合酶KOD及三磷酸脫氧核苷酸混合物(dNTPs) 購自TOYOBO公司，T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，DNA marker購自全式金公司，DNA膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Axygen公司，酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒購自Bio-tek公司，氨芐青霉素購自華北制藥股份有限公司，G418購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 DNA操作和序列分析

大腸桿菌感受態(tài)細胞制備、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒DNA的提取參照文獻[19]進行。酵母菌基因組 DNA提取及完整細胞轉(zhuǎn)化參照文獻[20]進行。使用OMEGA酵母質(zhì)粒提取試劑盒(Bio-tek, 美國) 提取酵母菌質(zhì)粒。絮凝基因表達水平分析參照文獻[21]進行。引物合成、序列測定由Invitrogen公司完成。

1.4 重組表達質(zhì)粒構(gòu)建

本研究所用引物序列見表2，以質(zhì)粒pFA6a- KanMX6 為模板，利用引物Kan-F和Kan-R進行PCR擴增，獲得約1.5 kb的，經(jīng)Ⅰ和Ⅰ酶切后的插入到載體YCp50上，獲得重組表達質(zhì)粒pYCPG。以釀酒酵母YS59的基因組為模板，利用引物ADH-F和ADH-R克隆啟動子序列，經(jīng)RⅠ和HⅠ酶切后，插入到質(zhì)粒pYCPG獲得重組質(zhì)粒pYCPGA1。分別以質(zhì)粒pYCF1和pYCF1c為模板，利用引物FLO1-F和FLO1-R分別克隆到完整及其衍生基因的編碼序列和終止子序列，將其連接到載體pYCPGA1的HⅠ和Ⅰ酶切位點之間，分別獲得重組表達質(zhì)粒pYGAF1和pYGAF1c。

表2 本文所用引物

aRestriction sites are underlined.

1.5 酵母菌絮凝能力測定

絮凝能力的常規(guī)測定參照文獻[17]進行，所用非絮凝緩沖液為50 mmol/L乙酸鈉 (pH 4.5)，絮凝緩沖液為含6.8 mmol/L氯化鈣的 50 mmol/L乙酸鈉(pH 4.5)。測定乙酸對酵母菌絮凝影響時，在菌懸液中分別添加不同濃度乙酸。

1.6 酵母菌脅迫耐受性分析

活化后的酵母菌接種于2 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，離心收集細胞，經(jīng)無菌水洗滌兩次后，細胞重懸于2 mL無菌水中，并進行梯度稀釋，室溫下靜置2 h。將5 μL稀釋度分別為10–2–10–5的菌懸液接種于含不同濃度乙酸、乙醇或糠醛的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2 d，記錄各菌株生長情況。

參照文獻[22]分析比較各菌株在液體培養(yǎng)基中的乙酸脅迫耐受性。將活化后的酵母菌接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，以初始接種600為0.15的接種量分別轉(zhuǎn)接到50 mL含有不同濃度乙酸的YPD培養(yǎng)基(pH 4.5) 中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，定時取樣測定細胞干重，繪制生長曲線。分別取對數(shù)早期、中期和后期的數(shù)據(jù)進行分析，以(AM/AW)/(BM/BW) 的比值表示不同菌株的乙酸脅迫耐受性，其中AM是重組菌株在乙酸脅迫條件下的細胞干重，AW是對照菌株在乙酸脅迫條件下的細胞干重，BM是重組菌株在無乙酸脅迫時的細胞干重，而BW是對照菌株在無乙酸脅迫時的細胞干重。

1.7 酵母菌發(fā)酵性能分析

將活化后的酵母菌接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，以初始接種600為1.0的接種量分別轉(zhuǎn)接到100 mL含有0，0.6%，0.8%或1.0% (/) 乙酸的EFM培養(yǎng)基(pH 4.5) 中。添加乙酸后，培養(yǎng)基pH明顯降低，具體為3.70 (0.6%乙酸)、3.61 (0.8%乙酸) 和3.56 (1.0%乙酸)。30 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h后，進行厭氧發(fā)酵，定時取樣檢測各項發(fā)酵性能指標。實驗重復(fù)3次，每次每個條件設(shè)3個重復(fù)。細胞生物量、發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇含量測定參照文獻[23]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝基因在工業(yè)釀酒酵母中的表達

分別用空載體pYCPG、帶有完整絮凝基因及重復(fù)序列單元C缺失衍生基因的重組表達質(zhì)粒pYGAF1和pYGAF1c轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母CE6，在含500 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進行G418抗性比較、絮凝能力目測、酵母菌質(zhì)粒提取和PCR分析，以及絮凝基因表達水平分析，獲得具有相同G418抗性和絮凝基因、表達水平的重組菌株6-AF1和6-AF1c各6株，以及3株帶有空載體的對照菌株CE6-V。

絮凝能力分析結(jié)果表明，宿主菌CE6及空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V均沒有表現(xiàn)出絮凝特性，而重組菌株6-AF1和6-AF1c均表現(xiàn)出明顯的絮凝特性，絮凝能力約為酵母菌株YS59的1.5倍(圖1)。檢測的6株6-AF1之間絮凝能力沒有明顯差異，6株6-AF1c之間絮凝能力也沒有明顯差異。其中表達內(nèi)重復(fù)序列單元C完全缺失的衍生基因的工業(yè)釀酒酵母6-AF1c的絮凝能力是表達完整絮凝基因的工業(yè)釀酒酵母6-AF1絮凝能力的96.4%。與和在實驗室單倍體酵母菌株中表達的結(jié)果基本一致[17]。

圖1 不同酵母菌株絮凝能力比較

2.2 絮凝基因表達對酵母菌脅迫耐受性影響

在含不同濃度乙醇、糠醛及乙酸的YPD固體培養(yǎng)基上比較不同酵母菌株的生長情況，發(fā)現(xiàn)在乙醇和糠醛脅迫條件下，對照菌株CE6-V與重組菌株6-AF1和6-AF1c之間沒有表現(xiàn)出明顯的生長差異，但表達絮凝基因的工業(yè)釀酒酵母在乙酸脅迫條件下的細胞生長明顯優(yōu)于對照菌株(圖2)。檢測的所有6-AF1和6-AF1c菌株均表現(xiàn)出對乙酸脅迫的耐受性。表明絮凝基因的表達對工業(yè)釀酒酵母CE6的乙醇和糠醛脅迫耐受性沒有明顯影響，但提高了酵母菌應(yīng)對乙酸脅迫的耐受性。

進一步在含不同濃度乙酸的YPD液體培養(yǎng)基中比較不同酵母菌株的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.6%–1.0% (/) 乙酸脅迫下，重組菌株6-AF1和6-AF1c的乙酸脅迫耐受性分別是對照菌株的1.3–2.5倍和1.5–2.9倍(圖3)，說明通過表達絮凝基因賦予工業(yè)釀酒酵母絮凝特性可以明顯提高酵母菌應(yīng)對乙酸脅迫的耐受性，而且絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失使工業(yè)釀酒酵母表現(xiàn)出更高的乙酸脅迫耐受性。

2.3 乙酸脅迫下的發(fā)酵性能比較

乙醇發(fā)酵實驗結(jié)果表明，在無乙酸脅迫條件下，對照菌株CE6-V與重組菌株6-AF1和6-AF1c表現(xiàn)出非常相似的發(fā)酵性能，發(fā)酵12 h 后葡萄糖消耗完，乙醇濃度在15 h達到最高(圖4A)。在乙酸脅迫條件下，對照菌株和重組菌株的細胞生長和發(fā)酵速率均受到明顯抑制，但絮凝型的重組菌株表現(xiàn)出了更高的乙醇產(chǎn)率。在0.6% (/) 乙酸脅迫條件下(pH 3.70)，酵母菌株CE6-V、6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別為1.6，2.5和2.6 g/(L·h) (圖4B)；當乙酸濃度為0.8% (/) 時(pH 3.61)，酵母菌株CE6-V、6-AF1和6-AF1c乙醇產(chǎn)率分別為0.9，1.2 和2.5 g/(L·h) (圖4C)；乙酸濃度增加到1.0% (/) 時(pH 3.56)，對照菌株CE6-V、重組菌株6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)量分別在100 h、70 h和60 h時達最高值，其中6-AF1和6-AF1c的乙醇產(chǎn)率分別是對照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍 (圖4D)。在所有實驗條件下，帶有空載體的對照菌株CE6-V表現(xiàn)出與宿主菌CE6相同的發(fā)酵性能。檢測的所有6-AF1 菌株之間或6-AF1c菌株之間發(fā)酵性能沒有明顯差異。添加乙酸使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH有所降低，增強了乙酸的細胞毒性。在乙酸毒性增加的條件下，絮凝型重組菌株6-AF1和6-AF1c表現(xiàn)出明顯優(yōu)于對照菌株的發(fā)酵性能。可見絮凝基因的表達可以明顯提高工業(yè)釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性，縮短乙酸脅迫條件下的發(fā)酵周期；特別是內(nèi)重復(fù)序列單元C缺失后使這種效果更加明顯，使酵母菌株在乙酸脅迫條件下表現(xiàn)出更高的乙醇生產(chǎn)速率。

圖2 空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V及絮凝型重組酵母菌6-AF1和6-AF1c在不同脅迫條件下的生長情況

發(fā)酵結(jié)束后收集酵母細胞，檢測各酵母菌株的絮凝能力(圖5)。宿主菌CE6及空載體轉(zhuǎn)化菌株CE6-V沒有表現(xiàn)出絮凝特性，6-AF1和6-AF1c均表現(xiàn)出明顯的絮凝特性。在無乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，6-AF1和6-AF1c的絮凝能力是在常規(guī)YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞絮凝能力的1.4倍。一方面發(fā)酵液中較高濃度乙醇可能增強以p為啟動子的絮凝基因的表達，另一方面發(fā)酵后期酵母細胞表面特性 (細胞壁構(gòu)象、細胞表面電荷及疏水性等)發(fā)生不同于常規(guī)YPD培養(yǎng)的變化，從而影響細胞之間相互作用的強度[24]。在乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，酵母細胞的絮凝能力明顯降低；而且與菌株6-AF1c相比，乙酸對菌株6-AF1的絮凝表現(xiàn)出更強的抑制作用。一方面乙酸可能影響絮凝基因的表達，另一方面乙酸影響絮凝蛋白的構(gòu)象。將無乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束收集到的6-AF1和6-AF1c細胞重新懸浮于含不同濃度乙酸的絮凝緩沖液中，測定絮凝能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度乙酸對絮凝能力的影響與相應(yīng)乙酸濃度下發(fā)酵結(jié)束時菌株的絮凝能力變化趨勢基本一致。說明不同乙酸脅迫下絮凝能力的變化可能主要來源于乙酸對絮凝蛋白功能的影響。而且與完整的絮凝蛋白Flo1相比，F(xiàn)lo1c在乙酸脅迫壓力下的空間構(gòu)象更穩(wěn)定。這使得在高濃度乙酸脅迫條件下，6-AF1c表現(xiàn)出了比6-AF1更高的絮凝能力，這可能是菌株6-AF1c在乙酸脅迫條件下具有更高乙醇生產(chǎn)速率的重要原因。

圖5 不同酵母菌株乙酸脅迫發(fā)酵結(jié)束時絮凝能力比較

3 討論

酵母菌在發(fā)酵過程中常常面臨多種環(huán)境脅迫，嚴重地制約著發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效率。增強發(fā)酵菌種的工業(yè)環(huán)境適應(yīng)性和魯棒性對提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本具有重要意義。絮凝，作為細胞之間粘附的一種方式，不僅是工業(yè)發(fā)酵過程提供細胞分離及產(chǎn)品澄清的有效方法，同時也是細胞應(yīng)對環(huán)境脅迫的一種保護機制。一方面通過絮凝形成細胞團，外層細胞可以為內(nèi)層細胞提供保護屏障，另一方面絮凝過程的發(fā)生可能激發(fā)細胞內(nèi)環(huán)境的重構(gòu)，從而產(chǎn)生對外環(huán)境的適應(yīng)性。Smukalla等的研究發(fā)現(xiàn)絮凝可以使酵母細胞在乙醇壓力下的細胞存活率提高2倍[18]。在本研究中，絮凝型重組菌株及其非絮凝原始菌株在乙醇脅迫下的細胞生長沒有明顯的差異，這種與Smukalla等的研究結(jié)果的不一致性可能與宿主菌的遺傳背景有關(guān)[18]。然而，本研究首次發(fā)現(xiàn)在工業(yè)釀酒酵母中表達絮凝基因可以明顯提高酵母菌應(yīng)對乙酸脅迫的耐受性，從而縮短乙酸脅迫條件下的發(fā)酵周期，提高產(chǎn)物生成速率。而且，絮凝基因中重復(fù)序列單元C發(fā)生缺失使酵母菌表現(xiàn)出更強的乙酸脅迫耐受性和脅迫條件下更高的乙醇產(chǎn)率，這與重復(fù)序列單元C缺失的絮凝蛋白Flo1cp比絮凝蛋白Flo1p具有更高的構(gòu)象穩(wěn)定性有 關(guān)[17]。乙酸脅迫條件下發(fā)酵結(jié)束后，菌株6-AF1c表現(xiàn)出比6-AF1高的絮凝能力也說明了這一點。表達重復(fù)序列單元C缺失衍生基因在提高工業(yè)釀酒酵母乙酸脅迫耐受性上的有效性，不但為提高生物質(zhì)乙醇發(fā)酵效率提供了技術(shù)途徑，也將為提升酵母菌所參與的其他發(fā)酵工業(yè)過程效率提供重要思路。在對釀酒酵母遺傳修飾中，宿主菌遺傳背景有時對遺傳修飾效果產(chǎn)生一定影響[25-26]。通過對酵母菌絮凝能力的遺傳改造增強酵母細胞對乙酸脅迫的耐受性是否受宿主菌遺傳背景影響還需進一步研究，以便更好地指導(dǎo)絮凝特性在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用。

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(本文責編 郝麗芳)

Improvement of acetic acid tolerance and fermentation performance of industrialby overexpression of flocculent geneand

Zhaoli Du1,2, Yanfei Cheng1, Hui Zhu1,2, Xiuping He1, and Borun Zhang1

1,,,100101,2,100049,

Flocculent geneand its truncated formwith complete deletion of repeat unit C were expressed in a non-flocculent industrial strainCE6 to generate recombinant flocculent strains 6-AF1 and 6-AF1c respectively. Both strains of 6-AF1 and 6-AF1c displayed strong flocculation and better cell growth than the control strain CE6-V carrying the empty vector under acetic acid stress. Moreover, the flocculent strains converted glucose to ethanol at much higher rates than the control strain CE6-V under acetic acid stress. In the presence of 0.6% (/) acetic acid, the average ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.56 and 1.62 times of that of strain CE6-V, while the ethanol production rates of 6-AF1 and 6-AF1c were 1.21 and 1.78 times of that of strain CE6-V under 1.0% acetic acid stress. Results in this study indicate that acetic acid tolerance and fermentation performance of industrialunder acetic acid stress can be improved largely by flocculation endowed by expression of flocculent genes, especially.

industrial,flocculen gene, acetic acid tolerance, fermentationperformance

May 9, 2014; Accepted: May 23, 2014

Xiuping He. Tel: +86-10-64807356; E-mail: hexp@im.ac.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA022106).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2012AA022106) 資助。