翟興月等

摘要：采用硅膠柱色譜及薄層制備色譜等手段從真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）殼中分離純化出了3種化合物。對(duì)所獲得的化合物經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)、波譜分析和文獻(xiàn)對(duì)照的方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)，采用CCK-8方法對(duì)75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏進(jìn)行了抑制人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)測(cè)試。結(jié)果表明，從真海鞘殼中分離得到3種化合物分別為：Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）、膽甾醇（化合物2）和6-（2，，3，-Dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。體外測(cè)試表明，75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏具有顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的活性，可作為潛在的抗腫瘤藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：真海鞘；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定；人肝癌細(xì)胞HepG2

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）主要分布于日本的海男鹿半島以北的海域及韓國(guó)的東海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，味道鮮美，深受人們的歡迎。李春艷等研究了真海鞘的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其可食部分除了含有豐富的氨基酸及礦物質(zhì)以外，還含有豐富的必需不飽和脂肪酸[2]。近年來(lái)，遼寧和山東進(jìn)行了真海鞘的引進(jìn)和養(yǎng)殖，目前已經(jīng)形成一定的規(guī)?；B(yǎng)殖[3]。真海鞘體外是呈橙紅色具有很多乳頭狀突起的被囊（殼），是不可食部分，目前大多被當(dāng)成廢物廢棄[1]。

海洋生物生活環(huán)境與陸生生物的生活環(huán)境不同。海洋生物生活環(huán)境往往更加極端，如高鹽、高壓環(huán)境，它們?yōu)榱诉m應(yīng)這樣的生活環(huán)境，往往產(chǎn)生一些特殊結(jié)構(gòu)的代謝中間產(chǎn)物。海洋生物所含有的特殊結(jié)構(gòu)的代謝中間產(chǎn)物往往又成為潛在的藥源生物活性物質(zhì)。對(duì)真海鞘殼化學(xué)成分的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，對(duì)真海鞘殼化學(xué)成分分離及其浸膏抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，旨在為真海鞘殼的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）2013年10月于山東省威海市榮成尋山集團(tuán)采購(gòu)；人肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；D101大孔吸附樹(shù)脂柱購(gòu)于天津市海光化工有限公司；硅膠（20～300mesh，10～40 μm）及薄層層析硅膠（Silica gel for Thin-layer Chromatography，HG/ T2354-92）購(gòu)于青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠購(gòu)于Sigma公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒（Dojindo，CK04）來(lái)自株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1真海鞘殼浸膏的制備真海鞘殼（濕重21 kg）洗去泥沙，剪成約2 cm×2 cm的小塊，置于圓底燒瓶中，加入3倍量的75% EtOH，加熱回流提取2 h，提取3次，制成浸膏并稱重，放入冰箱中冷凍保藏備用。

依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對(duì)提取到的浸膏進(jìn)行3次萃取，濃縮，分別得到石油醚萃取部分（9 g）、乙酸乙酯萃取部分（13 g）和正丁醇萃取部分（16 g）。

1.2.2真海鞘殼化學(xué)成分的分離將石油醚萃取部分9 g溶于適量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15 g的300～400目硅膠并攪拌均勻，揮發(fā)溶劑使樣品充分吸附。用100 g 300～400目硅膠進(jìn)行濕法裝柱（2.5×70 cm），先用石油醚平衡，將混有石油醚萃取部分硅膠加入到柱的上層，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)比例進(jìn)行5個(gè)柱體積的洗脫，分別收集洗脫液（每組分約600 mL）。通過(guò)薄層層析法跟蹤檢測(cè)每個(gè)組分，并通過(guò)顯色結(jié)果合并濃縮各組分，共得到8個(gè)組分，記為a、b、c、d、e、f、g和h組分（根據(jù)極性從小到大標(biāo)記），a組分為化合物1（41 mg），對(duì)b組分進(jìn)行重結(jié)晶，得化合物2 （120 mg）。

將正丁醇萃取部分16 g溶于適量的乙酸乙酯中，并向其中加入24 g的300～400目硅膠并攪拌均勻，揮發(fā)溶劑使樣品充分吸附。用160 g 300～400目硅膠進(jìn)行濕法裝柱（3×100 cm），先用乙酸乙酯平衡，將混有正丁醇萃取部分硅膠加入到柱的上層，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)比例進(jìn)行5個(gè)柱體積的洗脫，分別收集洗脫液（每組分約600 mL）。通過(guò)薄層層析法跟蹤檢測(cè)每個(gè)組分，并通過(guò)顯色結(jié)果合并濃縮各組分，共得到9個(gè)組分，記為a、b、c、d、e、f、g、h和j組分（根據(jù)極性從小到大標(biāo)記），對(duì)c組分進(jìn)行制備薄層色譜層析，對(duì)刮板洗脫濃縮得到的組分進(jìn)行重結(jié)晶，得化合物3（10.5 mg）。

1.2.3結(jié)構(gòu)鑒定核磁共振光譜（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振儀（500/125 MHz）上進(jìn)行，以四甲基硅烷（TMS）作內(nèi)標(biāo)。

1.2.4真海鞘殼浸膏總甾體含量的測(cè)定按照田麗冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘殼浸膏進(jìn)行總甾體含量的測(cè)定[4]。

1.2.5體外抗腫瘤活性測(cè)定稱取真海鞘殼浸膏 40 mg ，用20 mL乙醇溶解配制成濃度為2 mg/mL的藥液備用。

將HepG2細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（3×103個(gè)細(xì)胞/孔），于37 ℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加藥之前在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。將藥液加入96孔培養(yǎng)板中，終濃度分別為2 μg/mL、20 μg/mL及200 μg/mL，共同孵育2 h、6 h、12 h、36 h，然后在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察。同時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后培養(yǎng)箱中孵育3 h，測(cè)定450 nm處的吸光值。

1.2.6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件作單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1真海鞘殼浸膏的制備及化學(xué)成分的分離

利用75%EtOH浸提所獲得的真海鞘殼浸膏親水性較大，其含水量為5.12%，其總甾體含量為14.13%。對(duì)真海鞘殼浸膏石油醚萃取部分進(jìn)一步分離，得化合物1和化合物2。

化合物1為白色似油狀物。13C NMR （126 MHz，CDCl3） δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44 （s），37.44 （s），37.17 （s），34.73 （s），33.89 （dd，J= 67.3，50.3 Hz），33.27 （s），32.82 （s），3200 （s），30.11 （m），29.78 （d，J= 5.1 Hz），29.74 （d，J= 5.1 Hz），29.44 （s），29.03 （m），27.16 （s），26.77 （s），24.54 （s），23.24 （s），22.73（m），19.77（m），14.20 （d，J= 7.8 Hz），11.46 （s），1092 （s），7.56 （s），1.06 （s）。以上波譜數(shù)據(jù)并結(jié)合維普數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，確定化合物1為Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式為C56H112O40（圖1）[5]。

圖1化合物1

化合物2為白色針狀固體，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-濃硫酸反應(yīng)呈陽(yáng)性，表明為甾體類化合物。13C NMR數(shù)據(jù)及維普數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，與膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品一致，可以確定化合物2為膽甾醇 （Cholesterol），分子式為C27H46O。

對(duì)真海鞘殼浸膏正丁醇萃取部分進(jìn)一步分離，得化合物3。化合物3為白色固體粉末，易溶于甲醇。1H NMR （600 MHz，DMSO-d6）數(shù)據(jù)如下： δ8.13 （s，1H），8.35 （s，1H），7.35 （s，1H），7.35 （s，1H），5.87 （d，1H，6.2 Hz），4.61 （dd，1H，6.0，11.4 Hz），4.14 （q，1H，3.3 Hz），3.96 （dd，1H，3.3，6.6 Hz），3.65 （dt，1H，12.0，4.0 Hz），3.56 （m，1H），5.45 （d，1H，7.0 Hz），5.18 （d，1H，5.2 Hz），5.44 （m，1H）。13C NMR （150 Mz，DMSO-d6） 數(shù)據(jù)如下： δ156.3，1563，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2，C-3，C-4，C-7，C-8），73.8 （C-1），71.0（C-1，C-4），86.0，62.1（C-1，C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)并結(jié)合維普數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，確定化合物3為生物堿6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式為C12H13NO6（圖2）[6]。

圖2化合物32.2抑制人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)活性測(cè)定

不同濃度的真海鞘殼總浸膏與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)，不同培養(yǎng)時(shí)間后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，結(jié)果如圖3。由圖3可以看出，HepG2細(xì)胞在無(wú)藥物添加的時(shí)候，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞以一定的速率增殖。當(dāng)真海鞘殼總浸膏濃度為2 μg/mL時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到36 h時(shí)，培養(yǎng)液吸光度值下降，表明HepG2細(xì)胞增殖受到一定抑制。隨著真海鞘殼總浸膏濃度增加，HepG2細(xì)胞增殖抑制效果逐漸增加。當(dāng)真海鞘殼總浸膏濃度增大到為200 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞增殖受到明顯抑制。

圖3HepG2細(xì)胞與不同濃度真海鞘殼

總浸膏共同培養(yǎng)的CCK-8檢測(cè)結(jié)果

真海鞘殼總浸膏與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)后，對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。對(duì)照組細(xì)胞邊界清楚，折光度好，胞質(zhì)飽滿（圖4A）。真海鞘殼總浸膏與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)后的細(xì)胞有破損現(xiàn)象，細(xì)質(zhì)內(nèi)充滿圓形、透明的顆粒，顯示有較多脂滴（圖4B）[7-8]。

A 對(duì)照組細(xì)胞；B 真海鞘殼總浸膏與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)后的細(xì)胞

圖4顯微鏡下HepG2細(xì)胞形態(tài)（20×）

3討論

對(duì)真海鞘殼75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分進(jìn)一步分離，得到2個(gè)化合物，分別為Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和膽甾醇（化合物2）。對(duì)真海鞘殼浸膏正丁醇萃取部分進(jìn)一步分離，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）?；衔?首次發(fā)現(xiàn)于從中國(guó)南海西沙群島永勝島附近海域里生長(zhǎng)的海綿中[5]?；衔?首次發(fā)現(xiàn)于板栗中[6]。在真海鞘殼中發(fā)現(xiàn)化合物1與化合物3是首次報(bào)道。

CCK-8法是一種優(yōu)于MTT法的檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的方法，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好的特點(diǎn)[9]。在本研究中，使用CCK-8法對(duì)真海鞘殼總浸膏與HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，真海鞘殼總浸膏對(duì)HepG2細(xì)胞具有顯著抑制作用，且有劑量依賴性。真海鞘殼總浸膏中含有多種化學(xué)成分，其中比較多的化學(xué)成分有總甾體化合物，達(dá)到14.13%，這提示我們進(jìn)一步研究，可以獲得潛在的具有抑制HepG2細(xì)胞的化學(xué)成分。

對(duì)真海鞘中活性物質(zhì)的研究報(bào)道不多。Shirakata等從真海鞘體壁中分離出29 kDa蛋白質(zhì)]。Harada-Azumi等從真海鞘血淋巴中分離出一種分子量為28 kDa的Ca2+依賴型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特異性的凝集素[11]。日本與韓國(guó)的研究者在真海鞘內(nèi)發(fā)現(xiàn)了甘氨酸甜菜堿、龍蝦肌堿、葫蘆巴堿、氧化三甲胺、三甲胺等化學(xué)成分[2]。在真海鞘中不斷發(fā)現(xiàn)的新化學(xué)成分，豐富了真海鞘活性物質(zhì)的數(shù)據(jù)，為利用真海鞘提供了更多的可能性。

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Isolation of constituents in Halocynthia roretzi Drasche sell and

inhibitory activity of extracts from H.roretzi against HepG2 cells

ZHAI Xingyue1，HOU Xiuxiu2，TONG Changqing2，DU Ying3，LI Wei2

（1.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；

2.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；

3.Dalian Center for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，China）

Abstract：Three compounds were isolated from Halocynthia roretzi Drasche shell by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on HepG2 cells of all extracts from H.roretzi sell were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that three compounds were obtained and identified as Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate （compound 1），cholesterol （compound 2） and 6-（2，3-dihydroxy-4-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol （compound 3）.All extracts from H.roretzi sell using 75% EtOH exhibited the potent inhibitory activities against HepG2 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.

Key words：Halocynthia roretzi Drasche；constituent；structural identification；HepG2 cells