蔡 琳，阮志燕,徐 軍

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 國(guó)際學(xué)院 健康管理教研室，廣東 廣州 510520；2.呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科 廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510120)

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HMGB1 RNAi抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞系EMT

蔡 琳1*，阮志燕1,徐 軍2

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 國(guó)際學(xué)院 健康管理教研室，廣東 廣州 510520；2.呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科 廣州呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510120)

目的探討HMGB1在肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用。方法設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HMGB1的小干擾RNA(siRNA)，體外培養(yǎng)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系細(xì)胞-A549細(xì)胞，將細(xì)胞分為4組：1)對(duì)照組，2)TGF-β1刺激組，3)RNAi組(TGF-β1+ HMGB1 siRNA)，4)RNAi陰性對(duì)照組(TGF-β1+ siRNA陰性對(duì)照)；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)；RT-PCR法檢測(cè)HMGB1和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的mRNA表達(dá)；Western blot法檢測(cè)α-SMA和HMGB1蛋白表達(dá)。結(jié)果TGF-β1刺激組細(xì)胞HMGB1和α-SMA 的mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)；RNAi組HMGB1、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)均較正常對(duì)照組顯著下降(P<0.01)。結(jié)論HMGB1可能參與了TGFβ1 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

RNA干擾；高遷移率族蛋白B1；α平滑肌肌動(dòng)蛋白；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化

肺纖維化是以肺實(shí)質(zhì)炎癥和進(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前較多資料提示上皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)失調(diào)是導(dǎo)致纖維化的重要環(huán)節(jié)，其中上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 (epithelial

to mesenchymal transition, EMT)是肺間質(zhì)纖維化關(guān)鍵的病理改變。

高遷移率族蛋白(high mobility group B1，HMGB1)是存在于真核細(xì)胞系內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，對(duì)調(diào)節(jié)染色體功能具有重要作用,該分子在胞質(zhì)和細(xì)胞外能調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)[1]。最近的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與組織纖維化有密切的關(guān)系[2- 3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)是促EMT作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。目前尚無TGFβ1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與HMGB1相互關(guān)系的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞

A549細(xì)胞系由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存；TGFβ1 (PeproTech公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara 公司)；鼠抗人α-SMA單克隆抗體(Sigma公司)；鼠抗人HMGB1單克隆抗體(Abnova公司)；HMGB1 siRNA, siRNA陰性對(duì)照(Invitrogen公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于5%的CO2，37℃ 人工培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁增殖，每周傳代2次。

1.3 細(xì)胞分組和處理

當(dāng)細(xì)胞增殖匯合至70%～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h使細(xì)胞靜止于同步期。采用隨機(jī)化的原則將細(xì)胞分為對(duì)照組，TGFβ1刺激組，RNAi組和RNAi陰性對(duì)照組。對(duì)照組未加刺激劑，加入與其他組等量PBS，靜置72 h；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)刺激組加入TGFβ1 (終濃度為10 μg/L) 刺激72 h；RNAi組在培養(yǎng)液中用脂質(zhì)體(Lipofectanmine2000)轉(zhuǎn)染25 μL siRNA(20 μmol/L)至細(xì)胞內(nèi)，靜置1 h后更換無血清必需培養(yǎng)基(MEM)，加入TGFβ1刺激72 h；RNAi陰性對(duì)照組用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染25 μL siRNA陰性對(duì)照(20 μmol/L)至細(xì)胞內(nèi)，靜置1 h后更換無血清MEM，加入TGFβ1刺激72 h。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

當(dāng)細(xì)胞分組處理72 h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)并拍照。

1.5細(xì)胞mRNA的提取和RT-PCR檢測(cè)HMGB1和α-SMA

于72 h后從6孔板中離心收集細(xì)胞,加入1 mL Trizol Reagent，按其說明書操作步驟提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物序列, 分別為: HMGB1引物:上游5′-ATG GGCAAAGGAGATCCTA-3′,下游5′-CCTCATCATCT TCCTCTTC-3′,長(zhǎng)度575 bp；α-SMA引物:上游5′-A CCCAGATTATGTTTGAGACC-3′，下游5′-CCGTCAG GCAGTTCGTAG-3′，長(zhǎng)度377 bp；GAPDH引物:上游5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-CAAAG TTGTCATGGATGACC-3′，長(zhǎng)度497 bp。所有引物序列均采用序列局部相似性查詢系統(tǒng)(BLAST)軟件分析,并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s， 72 ℃最后延伸10 min, 30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物4 μL瓊脂糖凝膠電泳，采用KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)成像。用圖像分析軟件進(jìn)行分析，以管家基因GAPDH條帶為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因與相應(yīng)內(nèi)參基因條帶吸光度的相對(duì)比值。

1.6Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞HMGB1和α-SMA蛋白表達(dá)

TGFβ1處理后收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。各組標(biāo)本加入蛋白上樣緩沖液行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育,二抗孵育, ECL發(fā)光顯色。采用KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)成像,圖像分析軟件進(jìn)行分析,以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算目的基因與內(nèi)參照吸光度的相對(duì)比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組A549細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間連接緊密。TGFβ1刺激組細(xì)胞間隙略變大，離散成單個(gè)，形態(tài)呈梭形，呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。RNAi陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)與TGFβ1刺激組無明顯差異。RNAi組絕大部分細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)鋪路石樣，細(xì)胞間連接顯著增加 (圖1)。

2.2RT-PCR檢測(cè)HMGB1和α-SMAmRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，TGFβ1刺激組細(xì)胞HMGB1和α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，RNAi組與TGFβ1刺激組比較HMGB1 mRNA表達(dá)較明顯減少(P<0.01)(圖2)。

2.3Westernblot檢測(cè)HMGB1和α-SMA蛋白表達(dá)

TGFβ1刺激組和RNAi組陰性對(duì)照組細(xì)胞α-SMA和HMGB1蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯增多(P<0.01)(圖3)。與TGFβ1刺激組相比，RNAi組α-SMA和HMGB1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01)(圖3)。

A.normal control group; B.TGFβ1 group; C.RNAi group; D.RNAi negative control group圖1 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變Fig 1 Morphological changes of each group cells (×200)

1.control group; 2.TGFβ1 group; 3.RNAi group; 4.RNAi negative control group; *P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with TGFβ1 group

1.control group; 2.TGFβ1 group; 3.RNAi group; 4.RNAi negative control group; *P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with TGFβ1 group

3 討論

EMT是上皮細(xì)胞在與周圍間質(zhì)的相互作用過程中逐漸獲得了某些間質(zhì)細(xì)胞特有性狀的現(xiàn)象。有研究表明，HMGB1能誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT, 從上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化并且表達(dá)α-SMA[4]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異?；罨腍MGB1參與了博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中EMT的發(fā)生，在轉(zhuǎn)分化的氣道上皮中觀察到HMGB1的異常高表達(dá)[5]。通過RNAi抑制HMGB1的表達(dá)之后，纖維化程度減輕，α-SMA的表達(dá)明顯減少[6]。

TGFβ是促EMT作用最強(qiáng)和最經(jīng)典的細(xì)胞因子，除直接誘導(dǎo)EMT外TGFβ還介導(dǎo)其他細(xì)胞因子誘導(dǎo)EMT的作用[7]。本研究顯示，在TGFβ1刺激細(xì)胞72 h后，A549細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，HMGB1表達(dá)亦顯著上調(diào)。通過RNAi抑制HMGB1表達(dá)后，α-SMA表達(dá)隨之明顯下調(diào)。表明TGFβ1誘導(dǎo)的EMT過程中存在HMGB1的活化表達(dá)，抑制HMGB1的表達(dá)能夠減輕TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，HMGB1可能參與了TGFβ1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

胞外的HMGB1通過與晚期糖基化受體(receptor of advanced glycation end-product, RAGE)和Toll樣受體(TLR)2/4結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[8]， RAGE是HMGB1的主要受體[9]，HMGB1與RAGE結(jié)合以后能活化CDC42/Rac和MAPKs信號(hào)通路，最終導(dǎo)致活化NF-κB通路[9]。RAGE的活化除了能活化其本身的信號(hào)通路以后，還能同時(shí)誘導(dǎo)TGFβ1信號(hào)通路活化[10]，而TGFβ1亦可介導(dǎo)RAGE的活化表達(dá), 在肝臟星狀細(xì)胞中TGFβ1能時(shí)間依賴性的提高RAGE蛋白的合成,給予RAGE抗體能減少間皮下纖維化過程中TGFβ1的表達(dá)[11]，因此HMGB1-RAGE通路和TGFβ1可能存在信號(hào)通路交叉活化。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)在TGFβ1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中，抑制HMGB1的表達(dá)能夠減輕TGFβ1 誘導(dǎo)的EMT。但這一過程中HMGB1如何影響TGFβ1誘導(dǎo)的EMT過程，HMGB1-RAGE通路和TGFβ1如何產(chǎn)生信號(hào)通路的交叉活化，還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HMGB1可能參與了TGFβ1 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。然而，TGF-β1活化HMGB1的途徑如何，特異性抑制HMGB1是否可以作為肺纖維化治療過程中的一個(gè)共同靶點(diǎn)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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HMGB1 RNAi inhibits TGF-β1 induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells

CAI Lin1*, RUAN Zhi-yan1, XU Jun2

(1.Dept. of Health Management, International School, Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520; 2.Institute of Respiratory Disease, the First Affiliated Hospital, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510520, China)

ObjectiveTo investigate the role of HMGB1 in epithelial-mesenchymal transition.MethodsSpecific siRNA of HMGB1 was designed and synthesized. Cultured typeⅡ alveolar epithelial cell line-A549 cells were divided into 4 groups:1)control group, 2)model group induced by TGF-β1, 3)HMGB1 RNAi group, 4)RNAi negative control group. Cellular morphology changes were observed by phase-contrast microscope. HMGB1 and α-SMA expression in A549 cells was detected by RT-PCR and Western blotting respectively.ResultsmRNA and protein expression of HMGB1 and α-SMA in TGF-β1 group increased significantly than that in control group(P<0.01). HMGB1, α-SMA mRNA and protein expression in siRNA-treated cells decreased significantly as compared with that in TGF-β1 group(P<0.01).ConclusionsHMGB1 may be involved in the TGF-β 1 induced EMT.

RNAi; high mobility group B1; α-smooth muscle actin; epithelial-mesenchymal transition

2014- 06- 12

：2014- 10- 08

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2013068)；廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2012YZ006)

*通信作者(correspondingauthor)：lin_cai@126.com

1001-6325(2015)02-0183-04

研究論文

R 563

：A