吳宗山，胡海洋，任藝，李莉，

（1 北京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100083；2 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

銀的抗菌性早已廣為人知并被加以利用，如用銀絲織成紗布包裹皮膚創(chuàng)傷、用銀器存放食物防止腐敗[1]等。但在20 世紀(jì)30 年代，人們發(fā)現(xiàn)了抗生素并開(kāi)始大量使用，銀系抗菌材料被忽視。近年來(lái)，由于抗生素的濫用導(dǎo)致大量細(xì)菌發(fā)生變異并產(chǎn)生耐藥性，如大腸桿菌對(duì)卡那霉素和鏈霉素的耐藥性，傷寒桿菌對(duì)氯霉素的耐藥性[2-3]等。因此，以納米銀（silver nanoparticle，SNP）為代表的新型低成本安全性高的抗菌材料又引起了人們的關(guān)注[3-5]。目前，SNP 在洗手液、衣物、洗衣機(jī)、食品包裝和醫(yī)用導(dǎo)管以及傷口敷料等抗菌領(lǐng)域已有大量應(yīng)用[5-6]。雖然有學(xué)者采用綠色熒光蛋白標(biāo)記法對(duì)SNP 與微生物之間的作用進(jìn)行了研究[6]，但是SNP 的抗菌機(jī)理依然尚未研究清楚，而這對(duì)SNP 抗菌材料的進(jìn)一步設(shè)計(jì)、研究和應(yīng)用產(chǎn)生不利影響。本文將對(duì)SNP 的抗菌機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 SNP 材料的抗菌特性

SNP 單體材料及其復(fù)合材料，均表現(xiàn)出良好抗菌性[2，6]。與傳統(tǒng)材料相比，SNP 優(yōu)點(diǎn)明顯。首先，SNP 安全性高。相比較Ag+，SNP 在納摩爾或微摩爾濃度，即對(duì)微生物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗菌性[7-8]，而對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較低且少有并發(fā)癥[8]。其次，持久性好。SNP 負(fù)載于殼聚糖等載體上持續(xù)釋放出Ag0，維系較為恒定的銀濃度，達(dá)到持久抗菌目的[9-10]。第三，廣譜抗菌[10]。SNP 能夠有效抑制包括金黃色釀膿葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）和綠膿假單胞菌等多種致病細(xì)菌[11-13]以及皮膚癬菌等真菌在內(nèi)的650 余種致病菌[14]，甚至可殺死HIV-1[8]。第四，不易產(chǎn)生耐藥性。經(jīng)過(guò)SNP 處理的細(xì)菌基本無(wú)法存活，可杜絕細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性[7]。只有極少子代細(xì)菌出現(xiàn)抗菌性[14]，如假單胞菌AG259[15]等。此外，SNP 毒副作用小、使用便捷，也是SNP 抗菌材料應(yīng)用的主要原因之一[5，12]。

盡管SNP 材料抗菌優(yōu)勢(shì)明顯，但也暴露出一些問(wèn)題，特別是銀積累和遷移造成的生理和環(huán)境安全問(wèn)題[2]。如銀富集到較高濃度時(shí)對(duì)人體和哺乳動(dòng)物有較大危害，會(huì)伴隨呼吸進(jìn)入線粒體、胚胎以及肝臟和循環(huán)系統(tǒng)等[13]。Hussain 等[14]研究指出SNP 比Al 和Au 等金屬納米顆粒毒性更強(qiáng)，因此SNP 抗菌材料的應(yīng)用范圍和使用劑量也值得關(guān)注[15-17]。

2 SNP 材料的抗菌原理

目前SNP 的抗菌機(jī)理研究主要針對(duì)E.coli 和S.aureus 展開(kāi)，而對(duì)真菌的研究較少[12-13]，可見(jiàn)SNP的抗菌機(jī)制研究尚不充分[15-17]。通常認(rèn)為是SNP 釋放Ag+發(fā)揮作用并誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS）[18-20]。而Taylor 等[19]研究發(fā)現(xiàn)SNP 本身直接發(fā)揮抗菌作用，并協(xié)同釋放的Ag+發(fā)揮作用，而銀鹽（硫胺嘧啶銀鹽等）只通過(guò)釋放Ag+發(fā)揮抗菌作用顯著。Sukdeb 等[18]研究表明SNP 對(duì)多數(shù)細(xì)菌的抗菌性強(qiáng)于微米銀和Ag+，并歸因于小尺寸效應(yīng)引起的表面電子結(jié)構(gòu)特異性[13]。

2.1 影響細(xì)菌生活環(huán)境

在溶液中，受O2和質(zhì)子（H+）協(xié)同作用，SNP釋放出Ag+或被O2氧化形成納米Ag2O 再釋放Ag+，發(fā)揮抗菌作用[15，18]。機(jī)理如式（1）所示。

Xiu 等[2]認(rèn)為SNP 本身對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)無(wú)影響，抑菌作用源于釋放Ag+，且嚴(yán)格依賴O2濃度。Yoshinobu 等[21]研究也表明在有氧條件下SNP 和Ag2O 顆粒都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌性[16]。但細(xì)菌有氧呼吸等新陳代謝極大降低了O2含量，導(dǎo)致Ag+濃度降低并失去抑菌能力。而環(huán)境中O2濃度下降，對(duì)需氧細(xì)菌的影響巨大，直接抑制甚至殺死細(xì)菌。此外，Ag+可與體系中的營(yíng)養(yǎng)元素絡(luò)合，降低細(xì)菌生長(zhǎng)所必需元素的濃度，如Ag+可抑制E.coli 對(duì)磷酸鹽的吸收，致使菌體內(nèi)的磷元素凈流失，此外包括甘露醇、琥珀酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽和脯氨酸等營(yíng)養(yǎng)元素丟失，從而發(fā)揮抑菌活性[21]。

也有研究表明，SNP 誘導(dǎo)O2產(chǎn)生氧離子O2-，H2O 產(chǎn)生—OH。加劇消耗O2的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行攻擊[22]。在較高濃度Ag+下，Ag+可重新聚集形成Ag0[23]，因此該過(guò)程不斷持續(xù)消耗O2并發(fā)揮抑菌作用。

2.2 破壞細(xì)胞壁

Ag+和SNP（負(fù)載正電荷）通過(guò)與帶有負(fù)電荷的菌體蛋白質(zhì)（部分E.coli 等）之間的靜電吸引，吸附在細(xì)胞膜上[22-23]。因其較高的表面能和分散性，SNP 與細(xì)胞壁之間發(fā)生化學(xué)作用并破壞細(xì)胞壁的完整性，在細(xì)胞壁富集電子部位表現(xiàn)更為明顯[21]，導(dǎo)致細(xì)胞壁正常功能喪失，如營(yíng)養(yǎng)滲透等[9]。同時(shí)，SNP 和Ag+作為膜的過(guò)氧化誘導(dǎo)劑，與部分蛋白和磷酸脂質(zhì)（phosphate lipids）作用，誘導(dǎo)膜中損傷或分解[18，24]。如圖1 所示，經(jīng)過(guò)50 μg/L SNP 處理的E.coli 細(xì)胞電子顯微鏡圖片，E.coli 細(xì)胞壁有穿孔痕跡，細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，大小異常且細(xì)胞壁遭到破壞[9]。

Sonit 等[6]指出粒徑小于20 nm 的SNP 易與含硫蛋白結(jié)合，干擾蛋白功能并引起細(xì)胞壁滲透性變大。這與此前研究結(jié)果一致，說(shuō)明滲透性改變是抗菌的重要途徑[8]。如E.coli 短時(shí)間暴露在可抑菌濃度的SNP 中，細(xì)菌的蛋白質(zhì)前體聚集明顯，培養(yǎng)基中的還原糖增加了3 倍，蛋白提高2 倍[9]。細(xì)胞質(zhì)中的還原糖、蛋白質(zhì)和K+等營(yíng)養(yǎng)元素泄漏[25]，表明細(xì)胞外膜受損，細(xì)菌的跨膜運(yùn)輸失控，正常新陳代謝遭到破壞[9]，并得到了電泳實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證[16]。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)元素丟失，導(dǎo)致代謝途徑紊亂是細(xì)菌致死的重要原因。細(xì)胞壁受到Ag+攻擊，導(dǎo)致質(zhì)子動(dòng)力泵和膜電位遭到破壞[21]，菌體中的三磷酸腺苷（ATP）迅速下降，直接致死[26]。如霍亂弧菌的質(zhì)子動(dòng)力由于細(xì)胞壁受Ag+作用后崩潰，因跨膜質(zhì)子梯度消失而死亡[20]。但此類研究并未指明SNP 是與脂多糖或脂蛋白之間相互作用的可能機(jī)制。

圖1 不同用量SNP 處理后的E.coli 細(xì)胞形態(tài)變化[9]

因此，SNP 作用于細(xì)菌時(shí)，首先與細(xì)菌細(xì)胞壁之間由靜電作用結(jié)合，后與磷、巰基等含供電子基蛋白結(jié)合形成—S—Ag 和—S—SNP，進(jìn)而緊密吸附于細(xì)胞壁上[15，21]，破壞細(xì)胞壁完整性，甚至導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分解，譬如經(jīng)過(guò)SNP 處理后無(wú)法形成菌落[9]。

2.3 抑制DNA 復(fù)制

SNP 通過(guò)膜蛋白和脂質(zhì)作用（包括滲透性改變和穿孔等），突破細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。SNP 進(jìn)入菌體內(nèi)，聚集形成低分子量的聚集體，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜分離，使得DNA 為免受SNP 破壞而聚集濃縮，致使DNA 停留在復(fù)制間期而無(wú)法完成復(fù)制過(guò)程[21]。或者通過(guò)阻斷細(xì)菌內(nèi)的電子傳輸系統(tǒng)增強(qiáng)細(xì)菌DNA 的穩(wěn)定性，DNA 無(wú)法解開(kāi)雙螺旋，失去復(fù)制能力，細(xì)胞分裂速度下降[27]。

SNP 和Ag+通過(guò)與含大量供電子原子的細(xì)胞核、擬核以及線粒體的DNA 結(jié)合[11，17]，抑制DNA復(fù)制甚至喪失復(fù)制能力[7，14]。有報(bào)道指出SNP 與DNA 堿基中磷絡(luò)合形成交叉鏈接，使嘧啶或嘌呤中相鄰氮原子間的氫鍵被置換，分子內(nèi)磷酸二酯鍵被破壞，形成嘧啶二聚體，雙螺旋結(jié)構(gòu)消失，引起DNA雙鏈斷裂且無(wú)法修復(fù)、真菌染色體重排等變性行為[20]。而Siddhartha 等[28]研究認(rèn)為，還可能存在一種對(duì)細(xì)胞的分裂與活性十分關(guān)鍵的肽底物，通過(guò)對(duì)其絡(luò)氨酸的磷酸調(diào)控，如導(dǎo)致DNA 變性抑制DNA復(fù)制[24]。

2.4 抑制酶呼吸作用

諸多研究[11，17]認(rèn)為SNP 抑制細(xì)菌呼吸作用是另一抗菌方式，途徑包括降低菌體內(nèi)外O2濃度、直接作用于呼吸和ATP 生成相關(guān)酶。

SNP 溶解釋放Ag+過(guò)程消耗O2，而O2在細(xì)菌環(huán)境和菌體內(nèi)的溶解度降低，則有效抑制細(xì)菌呼吸[29]。如E.coli 體內(nèi)葡萄糖、甘油、延胡索酸酯和琥珀酸的氧化等減緩顯著，說(shuō)明呼吸相關(guān)酶活性受到抑制[25]。Li 等[9]研究發(fā)現(xiàn)呼吸鏈酶經(jīng)過(guò)粒徑5nm，濃度5μg/L SNP 處理10min 后，酶活性與未經(jīng)處理酶的活性相差7 倍，且酶活性與SNP 濃度呈顯著反比關(guān)系。Hussain等[14]研究發(fā)現(xiàn)SNP在較低濃度（5～50μg/L）即表現(xiàn)出對(duì)線粒體的強(qiáng)烈破壞作用，而其他納米粒子MoO3、Al 和Fe3O4等則在較高濃度（100～250μg/L）表現(xiàn)出類似效應(yīng)。此外，SNP 還可通過(guò)降低線粒體的膜電位抑制真核生物呼吸作用[15]。

SNP 穿過(guò)細(xì)胞壁滲透進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)，突破周質(zhì)障礙，溶解形成Ag+[21]。如圖2 所示，Ag+與SNP在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)與有氧呼吸氧化磷酸化過(guò)程中的黃素蛋白（NADH 脫氫酶）中的巰基作用，抑制呼吸鏈脫氫酶活性，破壞呼吸鏈[24，30]。這與已有研究結(jié)果一致，即通過(guò)抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-泛醌氧化還原酶（NADH-URE）干擾呼吸鏈[14，17]。誘導(dǎo)O2獲得電子生成O2-并最終轉(zhuǎn)化為H2O2[11]，誘導(dǎo)水產(chǎn)生—OH 和其他活性氧ROS（O·和O2-）[16，21]，阻斷了電子傳遞。ROS 氧化蛋白質(zhì)和DNA 使之受損，誘導(dǎo)Ag+釋放速度加快[31-32]。伴隨ATP 產(chǎn)量下降，細(xì)菌呼吸效率降低呼吸速率加快[19]，ROS 迅速積累，直至菌體死亡。

圖2 SNP 抑制呼吸鏈過(guò)程[30]

2.5 抑制其他酶活性

SNP 進(jìn)入細(xì)胞，因靜電吸引，首先與胞內(nèi)負(fù)載有負(fù)電荷的酶、蛋白質(zhì)組或細(xì)胞器和脂質(zhì)結(jié)合[22-33]，進(jìn)而與酶中的硫、氧和氮等電子供體（L-半胱氨酸等）結(jié)合[11]甚至替換酶中金屬離子[30]，致使酶活性鈍化甚至失活[29]。在創(chuàng)傷輔料中，SNP 通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制其生長(zhǎng)因子的降解作用，提高創(chuàng)傷愈合速度。此外，Ag+和SNP 與功能蛋白中的氨基酸殘基（半胱氨酸巰基）、氨基、咪唑、磷酸和羧基等親核性基團(tuán)結(jié)合，改變酶三維構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白不可逆變性，細(xì)菌正常代謝無(wú)法進(jìn)行[12，17-18]。而在革蘭氏陰性菌中，SNP 作用于磷酸酪氨酸多肽，觀察到磷酸酪氨酸去磷酸化，而蛋白質(zhì)的磷酸化過(guò)程與細(xì)菌體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[34]，據(jù)此推斷SNP 通過(guò)影響菌體的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制或中斷細(xì)菌的生長(zhǎng)。

綜上所述，SNP 的抗菌可能是通過(guò)下列途徑進(jìn)行（圖3）：SNP 在溶液中部分溶解釋放出Ag+。SNP和Ag+錨定在細(xì)菌細(xì)胞壁上帶有負(fù)電的功能團(tuán)上，功能蛋白受銀的作用，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，功能紊亂，尤其是改變膜的滲透性[35-36]，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)引起細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)元素流失。銀在細(xì)胞質(zhì)中損壞DNA 結(jié)構(gòu)抑制其復(fù)制以及呼吸鏈酶等相關(guān)酶活性[13]，最終導(dǎo)致細(xì)菌失活。但是在實(shí)際環(huán)境中由于O2的存在，SNP 變化涉及到復(fù)雜生化過(guò)程包括SNP 聚集、Ag+釋放、Ag+與有機(jī)物等絡(luò)合以及溶解沉淀平衡等[37-38]，SNP 抑菌過(guò)程仍然有待于進(jìn)一步深入研究。

3 抗菌性影響因素

SNP 抗菌性受SNP 的粒徑、保護(hù)劑、濃度、形貌、電荷、溶解度、溶液離子強(qiáng)度和pH 值、溶解氧濃度[16-19，32-41]等影響，并因菌種及其濃度不同而異[17]。表1 中列出了已報(bào)道的多種SNP 的抗菌性研究，結(jié)果表明SNP 的最低抑菌濃度（MIC）受多種因素影響。下面分別討論這些因素的影響。

3.1 粒徑的影響

SNP 粒徑的分布對(duì)抗菌性有決定性影響[16]，表現(xiàn)為SNP 抑菌性隨粒徑增大而顯著下降[4]。在OD600法檢測(cè)菌落數(shù)的生長(zhǎng)曲線中體現(xiàn)十分明顯，隨著SNP 粒徑的降低，細(xì)菌的生長(zhǎng)周期顯著延緩[28]。尤其是小于10nm 時(shí)，SNP 表現(xiàn)出極佳抗菌性[35]。

Kaviya 等[42]研究發(fā)現(xiàn)粒徑為8nm 和33nm SNP前者的抗菌性更強(qiáng)。Choi 等[16]認(rèn)為，粒徑為(14±6)nm 的SNP 很難進(jìn)入菌體內(nèi)，而粒徑分布為3～39nm 的SNP 中，只有粒徑處于1～10nm 之間的SNP 能夠吸附在細(xì)胞膜表面，如進(jìn)入E.coli 的SNP 粒徑分布在(5±2)nm，說(shuō)明只有較小粒徑的SNP才能進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。由于SNP 粒徑減小103倍，比表面積增大109倍[17]，表面能升高，利于釋放Ag+和Ag0[2]，提高抗菌活性[6]。大粒徑SNP 比表面積小，附著能力降低，Ag+釋放量減少[3]，(11.2±0.9)nm的SNP 的Ag+釋放量是(20±10)nm 的14 倍[35]。因此，多數(shù)研究者[1，3]認(rèn)為，SNP 抗菌性與其較高的表面能和表面原子數(shù)相關(guān)。但是粒徑通過(guò)影響SNP 聚集動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致沉降也會(huì)間接對(duì)抗菌性產(chǎn)生影響，小粒徑SNP 不僅布朗運(yùn)動(dòng)劇烈，其表面電動(dòng)電勢(shì)較大粒徑SNP 更低且靜電斥力影響有限，因此同質(zhì)量濃度的SNP，粒徑較小的SNP 數(shù)目密度更大發(fā)生聚集的概率也更高[43]。

圖3 SNP 的抗菌模型

表1 中的MIC 值較高，是由于在實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌濃度大，在實(shí)際生活中是不存在這種高濃度細(xì)菌環(huán)境[3]。

3.2 形貌影響

研究表明，抗菌性SNP 的形貌緊密聯(lián)系，尤其是大比表面積的SNP 可與細(xì)菌更好結(jié)合[17]。不同形貌的SNP 的晶面種類和比例不同，而晶面的穩(wěn)定性和催化活性的各向異性導(dǎo)致SNP 吸附細(xì)胞壁及釋放Ag+能力有區(qū)別，抗菌性必然表現(xiàn)出顯著差異[11]。

目前，關(guān)于晶面影響抗菌性的詳細(xì)機(jī)制研究很少報(bào)道[19]。有報(bào)道認(rèn)為，(111)面的原子密度高，Ag0活性更強(qiáng)[23]，因此(111)面更易與細(xì)菌進(jìn)行結(jié)合，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌性[44]。例如三棱柱狀的SNP 比球形和棒狀SNP 針對(duì)E.coli 的抗菌性更好[17]，是由于球形SNP(100)晶面比例較(111)晶面多[45]，棒狀的SNP 側(cè)面是(100)面，而兩端是(111)面[19，44]。因此有研究預(yù)測(cè)十面體全部由(111)晶面構(gòu)成，抗菌性較強(qiáng)[23]?？梢?jiàn)，SNP 有效晶面比例不同，抗菌性差別明顯。

3.3 保護(hù)劑的影響

SNP 易聚合，在SNP 復(fù)合材料制備過(guò)程中往往使用穩(wěn)定劑，比如殼聚糖、纖維素、SDS、PVP 及抗生素[2，19]等。分子內(nèi)含有羥基和氨基數(shù)目較多的保護(hù)劑與SNP 結(jié)合，有利于SNP 穩(wěn)定保存，但同時(shí)對(duì)Ag0和Ag+的擴(kuò)散/遷移有抑制作用[41]，表現(xiàn)為對(duì)SNP 抗菌性的促進(jìn)或抑制作用。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下，SNP 的最低抑菌濃度（the minimum inhibitory concentration，MIC）[9-12，16-19，23，28-39]

保護(hù)劑在細(xì)菌細(xì)胞壁與SNP 之間的連接作用力不同[19]，抗菌效果也各異。Virender 等[19]以SDS作為穩(wěn)定劑，SNP 的抗菌性略有增強(qiáng)，以失水山梨醇單油酸酯聚乙烯醚（Tween-80）作為穩(wěn)定劑抗菌性受到抑制，而保護(hù)劑PVP 對(duì)SNP 的抗菌性無(wú)明顯影響。SDS 屬于離子型表面活性劑，對(duì)細(xì)胞壁的穿透作用力更強(qiáng)，尤其是對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌[19]，在保護(hù)劑和抗菌效性之間實(shí)現(xiàn)了平衡。Tween-80 是非離子型試劑，與細(xì)胞壁結(jié)合存在困難[8]。PVP 提高了SNP 穩(wěn)定性，因此有利于SNP 發(fā)揮抗菌性[14]。Aruna 等[1]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽、SDS 和PVP 制備的SNP 對(duì)S.aureus 和E.coli 抗菌性時(shí)，發(fā)現(xiàn)PVP 的抗菌性優(yōu)于SDS 和檸檬酸鹽。這是由于在其研究體系中pH 值和離子強(qiáng)度較高，PVP 可更好發(fā)揮穩(wěn)定功能，有效抑制SNP 的聚集沉降。而以殼聚糖為代表的陽(yáng)離子型保護(hù)劑有利于促進(jìn)SNP 吸附在負(fù)電膜蛋白上，可有效提高SNP 抗菌活性[17，46]。Badawy等[47]研究發(fā)現(xiàn)在不同保護(hù)劑下SNP 表面正負(fù)電荷不同導(dǎo)致顆粒聚集狀態(tài)不同，表現(xiàn)出對(duì)芽孢桿菌迥異的抗菌性。而易降解的保護(hù)劑檸檬酸能在一定時(shí)間內(nèi)促進(jìn)SNP 的溶解[5]。

但是研究穩(wěn)定劑對(duì)SNP 抗菌性的影響時(shí)存在一個(gè)明顯的問(wèn)題就是，不同穩(wěn)定劑下制備的SNP 尺寸及形貌差別巨大，部分文獻(xiàn)報(bào)道的粒徑差距甚至高達(dá)30～40nm，故難以準(zhǔn)確比較穩(wěn)定劑對(duì)SNP 抑菌性能的影響[16]。因此，有必要研究用不同穩(wěn)定劑制備出粒徑可控的SNP，本文作者課題組正在此方面進(jìn)行研究。

3.4 菌種影響

不同種細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有明顯差異，SNP 與之作用的蛋白種類和數(shù)目也有區(qū)別[17]。尤其是革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中肽聚糖厚度差異較大[10，31]。

革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層是脂質(zhì)和多糖通過(guò)共價(jià)鍵形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，整體缺乏強(qiáng)度和硬度[31]，因其較薄的細(xì)胞壁（約7～8nm）[2]，有利于SNP 吸附和穿透。在正常生長(zhǎng)環(huán)境的pH 值下，細(xì)胞壁脂多糖分子層因含較多羧基導(dǎo)致細(xì)胞外膜呈負(fù)電性[28]。SNP 容易吸附并錨定在細(xì)胞壁上，并與脂多糖發(fā)生化學(xué)作用。脂多糖是細(xì)胞壁維持細(xì)胞質(zhì)正常營(yíng)養(yǎng)滲透性的關(guān)鍵物質(zhì)之一[9]，而肽聚糖層多數(shù)屬于脂多糖，SNP 與脂多糖作用是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁滲透率和選擇性改變的主要原因[24]。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌缺乏無(wú)細(xì)胞膜、周質(zhì)間隙和脂多糖[31]。線性糖鏈可通過(guò)肽鍵交聯(lián)形成強(qiáng)度較高的細(xì)胞壁[28]，僅具備剛性的肽聚糖層（20～80 nm），缺乏錨定位點(diǎn)，增大了SNP 在細(xì)胞壁上的錨定難度[21]，表現(xiàn)為SNP 對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制作用更加明顯[24]。如SNP 對(duì)酵母菌和E.coli 的抗菌性強(qiáng)于S.aureus[10]，顯著高于P.aeruginosa 和V.cholera[31]。

此外，Choi 等[16]認(rèn)為SNP 對(duì)異養(yǎng)型微生物的抗菌性比自養(yǎng)型細(xì)菌更好，如對(duì)反硝化細(xì)菌的抗菌性較弱[14]。對(duì)于真菌，細(xì)胞核的核膜也可能影響到SNP 與DNA 之間的作用。有報(bào)道指出，由于原核生物由于沒(méi)有細(xì)胞器和核膜，SNP 的抗性遠(yuǎn)較真核生物更為明顯[29]。不過(guò)對(duì)此類的研究，需要針對(duì)更多菌種進(jìn)行研究工作，而目前還未很好開(kāi)展[10，20]。

3.5 溶液離子種類與強(qiáng)度影響

細(xì)菌的培養(yǎng)條件也會(huì)對(duì)抗菌測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響。根據(jù)Shulze-Hardy 規(guī)則， SNP 穩(wěn)定性還受電解質(zhì)化學(xué)價(jià)態(tài)的影響， Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek（DLVO）理論，一價(jià)和二價(jià)離子均會(huì)導(dǎo)致SNP 隨著離子強(qiáng)度升高逐漸沉降[48]。已有文獻(xiàn)研究了H+、Na+、K+、Mg2+和Ca2+等陽(yáng)離子以及F-、Cl-和Br-等陰離子對(duì)SNP 穩(wěn)定性和遷移的影響[47，49-52]。高濃度離子能壓縮SNP 雙電層或中和表面電荷，降低Zeta 電勢(shì)，減小靜電斥力，促進(jìn)SNP聚集[32，37，48]。因此，溶液Zeta 電勢(shì)越高，SNP 粒徑越小則其穩(wěn)定性越好[17，48]。但在一定范圍內(nèi)，Ag+釋放量與離子強(qiáng)度正相關(guān)，而與過(guò)高的離子強(qiáng)度則無(wú)明顯相關(guān)性[37]。SNP 在加入電解液中的數(shù)小時(shí)內(nèi)釋放Ag+能力迅速提高，而后逐漸下降[32]。Shao 等[48]研究SNP 在蒸餾水和海水中的溶解行為，發(fā)現(xiàn)在前者中的Ag+最終濃度是后者的2 倍。

此外，SNP 的表面電動(dòng)勢(shì)隨著H+濃度提高而升高，在中性和堿性條件下表面電動(dòng)勢(shì)則無(wú)明顯變化[32]。高濃度H+能夠削弱SNP 表層的雙電層保護(hù)作用，降低其穩(wěn)定性[28]，提高了SNP 的溶解性和Ag+釋放量[39]，而中性條件下SNP 很少溶解不易聚集沉降，表面積增加氧化程度提高，Ag+和ROS 減少[49-50]。Frank 等[36]通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)比較pH 值分別為6.5 和8.0 時(shí)SNP 的抗菌能力，前者的抗菌能力由第一天基本相同逐步擴(kuò)大到第20 天時(shí)是后者的8倍。有研究表明，SNP 在高濃度Na+和K+環(huán)境中協(xié)同光催化水產(chǎn)生OH-和H+，而Na+協(xié)同作用弱，高Na+環(huán)境中體系pH 值略微升高而K+導(dǎo)致pH 值明顯提高，納米顆粒間距分別減小和增加[49]，因此Na+環(huán)境中SNP 易聚集沉淀。K+因其離子半徑較大對(duì)SNP 粒徑影響略遜于Na+，因此不同半徑價(jià)態(tài)離子的影響也不相同[51]。如對(duì)于適量的Ag+螯合劑Cl-，由于形成溶解性更好的AgCl2-或AgCl3-，SNP 抗菌性反而略有增強(qiáng)[52]。Liesje 等[35]按Cl-∶Ag+為1∶2.5（質(zhì)量比）向SNP 中添加Cl-，Ag+濃度迅速由0.56mg/L 降至0.02mg/L。而不同離子種類和濃度對(duì)SNP 影響的研究仍然較少，此方面的工作需要進(jìn)一步展開(kāi)[49]。

3.6 溶解氧影響

溶解氧通過(guò)影響SNP 的溶解性、粒徑及Ag+的釋放量影響SNP 的抗菌性，甚至有研究認(rèn)為SNP毒性主要依賴于氧化還原條件[50]，也有個(gè)別文獻(xiàn)認(rèn)為O2的影響作用有限[35]。SNP 的溶解性隨著溶解氧濃度的提高而增強(qiáng)，溶解過(guò)程見(jiàn)式（2）[32]。

Liu 等[43]研究表明溶解氧濃度低于0.1mg/L 時(shí)，SNP 溶解性受到明顯抑制。長(zhǎng)時(shí)間暴露于O2中的SNP，由于表面氧化為不易溶解的Ag2O，因此Ag+釋放能力下降[22]。Zhang 等[32]研究發(fā)現(xiàn)在含氧7.8mg/L 溶液中，SNP 的粒徑先快速增加后不斷減小，在無(wú)氧條件下則呈緩慢線性增長(zhǎng)，有氧條件下SNP 擴(kuò)散系數(shù)減小，沉降速度約為無(wú)氧條件下的3～8 倍，這是由于SNP 在有氧條件下，Ag+釋放加速導(dǎo)致體系離子強(qiáng)度增加造成的。Emma 等[38]研究發(fā)現(xiàn)若除去溶解氧，則SNP 的ROS 和Ag+釋放量趨近于0 而與pH 值無(wú)相關(guān)性。酸性條件下，SNP還原電位隨著O2濃度提高而增加，因此在缺氧或厭氧條件下SNP 的Zeta 電動(dòng)勢(shì)降低，抑制了Ag+的擴(kuò)散[37]。也有研究[50]發(fā)現(xiàn)pH=7 時(shí)Ag+釋放量與溶解氧無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而pH=4 時(shí)釋放量增加了2～3 倍。此外，SNP 的氧化或者對(duì)Ag+的吸附也會(huì)引起其表面自由能變化[49]。

3.7 其他影響因素

此外，銀濃度也是影響抗菌性的重要因素[16]。由于單位面積細(xì)胞壁吸附的SNP 數(shù)目增多，滲透率變化迅速，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的SNP 和Ag+明顯增加[31]，所以SNP 的抗菌能力隨著濃度提高而顯著增加[22]。但是銀濃度過(guò)高會(huì)引起體系的離子強(qiáng)度增加，導(dǎo)致SNP 沉淀[31]。其他因素如培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)時(shí)間等也會(huì)對(duì)SNP 的抗菌性產(chǎn)生影響。培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，SNP 逐漸溶解，粒徑緩慢減小。培養(yǎng)基中的有機(jī)物種類及濃度亦會(huì)對(duì)SNP 的溶解沉降產(chǎn)生影響[38，47]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

綜上所述，納米銀的抗菌過(guò)程很復(fù)雜，并受多種因素的影響?？赡芙?jīng)歷的途徑包括：SNP/Ag+穿過(guò)細(xì)胞壁滲透進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)，突破周質(zhì)障礙，導(dǎo)致細(xì)胞膜成分泄漏，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，抑制DNA 的復(fù)制和酶的呼吸作用等，多種作用機(jī)制共同產(chǎn)生抑菌效果。SNP 的抗菌性不僅受自身粒徑分布、形貌、濃度、保護(hù)劑、溶液中的離子種類與強(qiáng)度、溶解氧等因素的影響，也與細(xì)菌的種類和培養(yǎng)基等多方面因素有關(guān)。但是目前對(duì)SNP 抗菌機(jī)理的研究還不全面，還有許多問(wèn)題需要深入研究和探討，比如SNP在抗菌過(guò)程中的作用，SNP 及其釋放的Ag+如何與細(xì)胞壁、DNA 和酶進(jìn)行相互作用，如何影響細(xì)菌的生化反應(yīng)和新陳代謝等，這些問(wèn)題的闡明將有助于納米銀抗菌材料的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。隨著科技的進(jìn)步，也可以嘗試應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)等新技術(shù)從基因和分子生物學(xué)水平上來(lái)研究和探討SNP 的抗菌機(jī)理。同時(shí)，關(guān)于SNP 抗菌性的影響因素，由于在現(xiàn)有的SNP 制備工藝中難以得到單一的影響因素對(duì)其抗菌性的影響，因此有必要開(kāi)展SNP 的形貌及尺寸控制研究，探討形貌、粒徑尺寸、濃度、保護(hù)劑等單一因素的影響，為進(jìn)一步提高SNP 的抗菌性提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，SNP在抗菌作用中，隨著化學(xué)環(huán)境的變化，其自身物理化學(xué)屬性的改變也是值得關(guān)注的研究方向。隨著SNP 抗菌材料的應(yīng)用，銀納米顆粒的暴露量、SNP的多樣性和其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化及其結(jié)構(gòu)活性與生物毒性的關(guān)系等方向?qū)⒊蔀橄乱徊窖芯抗ぷ鞯臒狳c(diǎn)和難點(diǎn)。

[1] Aruna J K，Lori R. Enhancement of antibacterial activity of capped silver nanoparticles in combination with antibiotics，on model gramnegative and gram positive bacteria[J].Bioinorg.Chem.Appl.，2013，18（10）：871097-871106.

[2] Xiu Z M ，Zhang Q B. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles[J]. Nano Letters，2012，12（8）：4271-4275.

[3] Marek J，Anna L，Stefan B，et al.Textile with silver silica spheres：Its antimicrobial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J].Sol-Gel Sci.Technol.，2009，3（51）：330-334.

[4] Chen X，Schluesener H J. Nanosilver，a nanoproduct in medicalapplication[J].Toxicol.Lett.，2008，176（1）：1-12.

[5] Lee W Y，Kim K J，Lee D G.Silver nanoparticles as a new generation of microbials[J].Biotechnol.Adv.，2009，27（1）：76-83.

[6] Sonit K G，Gopinath P，Anumita P，et al. Green fluorescent protein-expressing Escherichia coli as a model system for investigating the antimicrobial activities of silver nanoparticles[J].Langmuir，2006，22（22）：9322-9328.

[7] Shipra T，Mehrotra G K.Chitosan-silver oxide nanocomposite film：Preparation and antimicrobial activity[J].Mater.Sci.，2011，34（1）：29-35.

[8] Humberto H L，Nilda V A，Liliana I T. Mode of antiviral action of silver nanoparticles against HIV-1[J].J.Nanobiotechnology，2010，8（1）：21-28.

[9] Li W R，Xie X B，Shi Q S，et al.Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli[J]. Appl. Microbiol.Biotechnol.，2010，85（4）：1115-1122.

[10] 吳宗山，李莉. 天然產(chǎn)物綠色合成小尺寸納米銀及抗菌性[J]. 精細(xì)化工，2014，31（8）：964-973.

[11] You C G，Chun M H，Xin G W，et al. The progress of silver nanoparticles in the antibacterial mechanism，clinical application and cytotoxicity[J].Mol.Biol.Rep.，2012，39（9） ：9193-9201.

[12] 朱玲英，郭大偉，顧寧. 納米銀細(xì)胞毒性體外檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào)，2014，22（59）：2145-2152.

[13] Silver S. Bacterial silver resistance：Molecular biology and uses and misuses of silver compounds[J].FEMS Microbiol.Rev.，2013，27（2）：341-353.

[14] Hussain S M ，Hess K L ， Gearhart J M. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells[J].Toxicology in Vitro，2005，19（7）：975-983.

[15] Sukumaran P，Eldho K P. Silver nanoparticles：Mechanism of antimicrobial action，synthesis，medical applications，and toxicity effects[J].International Nano Letters，2012，2（32）：1-10.

[16] Choi O Y，Deng K K，Kim N J. The inhibitory effects of silver nanoparticles，silver ions，and silver chloride colloids on microbial[J].Water Research，2008，42（12）：3066-3074.

[17] Georgios A S，Sotiris E P.Antibacterial activity of nanosilver ions and particles[J].Environ.Sci.Technol.，2010，44（14）：5649-5654.

[18] Sukdeb P，Yu K T，Joon M S.Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle?A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli[J]. Environ. Microbiol.，2007，73（6）：1712-1720.

[19] Taylor P L ， Ussher A L ， Burrell R E. Impact of heat on nanocrystalline silver dressings：Chemical and biological properties[J].Biomaterials，2005，26（35）：7221-7229.

[20] Virender K S，Ria A Y，Yekaterina L. Silver nanoparticles：Green synthesis and their antimicrobial activities[J]. Adv. Colloid Interface Sci.，2009，145（28）：83-96.

[21] Yoshinobu M，Kuniaki Y，Shin-ichi K，et al. Mode of bactericidal action of silver zeolite and its comparison with that of silver nitrate[J].Appl.Environ.Microbiol.，2003，69（7）：4278-4281.

[22] Nelson D，Priscyla D M，Roseli D C，et al. Potential use of silver nanoparticles on pathogenic bacteria， their toxicity and possible mechanisms of action[J].J.Braz.Chem.Soc.，2010，21（6）：949-959.

[23] Maragoni V，Dasari A，Alle M，et al.A novel green one-step synthesis of silver nanoparticles using chitosan ： Catalytic activity and antimicrobial studies[J].Appl.Nanosci.，2014，12（1）：113-119.

[24] 鐘濤，楊娟，周亞洲，等. 納米銀-氧化石墨烯復(fù)合材料抗菌性能研究進(jìn)展[J]. 材料導(dǎo)報(bào)，2014，1（28）：64-71.

[25] 唐詩(shī)璟，鄭雄，陳銀廣. 水體環(huán)境中納米銀的來(lái)源、遷移轉(zhuǎn)化及毒性效應(yīng)的研究進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展，2013，32（11） ：2727-2733.

[26] Su H L，Chou C C，Hung D J，et al. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay[J].Biomaterials，2009，30（30）：5979-5987.

[27] An J，Zhang H，Zhang J，et al.Preparation and antibacterial activity of electrospun chitosan/poly(ethylene oxide) membranes containing silver nanoparticles[J]. Colloid Poly. Sci.，2009，339（287）：1425-1434.

[28] Siddhartha S，Tanmay B，Arnab R，et al.Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles[J]. Nanotechnology，2007，9（18）：225103-225112.

[29] Arakawa H，Neault J F，Tajmir-Riahi H A.Silver(Ⅰ)complexes with DNA and RNA studied by fourier transform infrared spectroscopy and capillary electrophoresis[J]. Biochemistry，2005，87（44）：1580-1587.

[30] Durán N，Marcato P D，Alves L O，et al. Mechanistic aspects of biosynthesis of silver nanoparticles by several Fusarium oxysporum strains[J].Esposito E.J.Nanobiotechnol.，2005，3（8）：1-8.

[31] Umadevi M，Rani T，Balakrishnan T，et al.Antimicrobial activity of silver nanoparticles prepared under an ultrasonic field[J].Environ.Sci.Technol.，2011，5（4）：1941-1946.

[32] Zhang W，Yao Y，Li K G，et al. Influence of dissolved oxygen on aggregation kinetics of citrate-coated silver nanoparticles[J].Environmental Pollution，2011，31（159）：3757-3762.

[33] Abdelgawad A M，Hudson S M，Rojas O J.Antimicrobial wound dressing nanofiber mats from multicomponent（chitosan/silver-NPs/polyvinyl alcohol） systems[J].Carbohydr.Polym.，2012，16（1）：43-51.

[34] Zachary F，Cameron S，Caroline D，et al.Straightforward，one-step synthesis of alkanethiol-capped silver nanoparticles from an aggregative model of growth[J].Langmuir，2013，30（5）：9291-9300.

[35] Liesje S，Paul V M，Willy V N B. The antibacterial activity of biogenic silver and its mode of action[J]. Appl. Microbiol.Biotechnol.，2011，91（1） ：153-162.

[36] Frank S R R，Katharina S，George M，et al. Effects of silver nanoparticle properties，media pH and dissolved organic matter on toxicity to Daphnia magna[J]. Ecotoxicol. Environ. Saf.，2014，111（5）：263-270.

[37] Gao J，Youn S，Hovsepyan A，et al. Dispersion and toxicity of selected manufactured nanomaterials in natural river water samples：Effects of water chemical composition[J]. Environ. Sci. Technol.，2009，43（9）：3322-3328.

[38] Emma K F，Vinka O C. Disinfection action of electrostatic versus steric-stabilized silver nanoparticles on E. coli under different water chemistries[J].Colloids Surf.B Biointerfaces，2014，16（113）：77-84.

[39] Beatriz P，Sarah J，Dorleta J A，et al.The state of nanoparticle-based nanoscience and biotechnology：progress，promises，and challenges[J].ACS Nano，2012，6（10）：8468-8483.

[40] Nabil A A，Lakshmi P，Kotra W，et al. High-resolution atomic force microscopy studies of the escherichia coli outer membrane：Structural basis for permeability[J]. Environ. Sci. Technol.，2011，16（45）：2789-2796.

[41] Amanulla M F，Kulandaivelu B，Morukattu G，et al. Biogenic synthesis of silver nanoparticles and their synergistic effect with antibiotics：A study against gram-positive and gram-negative bacteria[J]. Nanomedicine，2010，18（6）：103-109.

[42] Kaviya S，Santhanalakshmi J，Viswanathan B. Biosynthesis of silver nanoparticles using citrus sinensis peel extract and its antibacterial activity[J]. Spectrochim Acta A：Mol. Biomol. Spectrosc.，2011，79（3）：594-598.

[43] Liu J. Ion release kinetics and particle persistencein aqueous nano-silver colloids[J]. Environ. Sci. Technol.，2010，44（6）：2169-2175.

[44] Benjamin W，Sun Y G，Brian M. Shape-controlled synthesis of metal nanostructures：The case of silver[J]. Chem. Eur. J.，2005，10（11）：45-46.

[45] Gourishankar A，Sourabh S，Krishna N G，et al. Isothermal titration calorimetry studies on the binding of DNA bases and PNA base monomers to gold nanoparticles[J]. J. Am. Chem. Soc.，2004，126（41）：1316-1317.

[46] Anna R，Silvia I，Agnieszka K，et al. Preparation and characterization of chitosan-silver nanocomposite films and their antibacterial activity against Staphylococcus aureus[J]. Nanotechnology，2013，24（1）：15101-15122.

[47] Badawy E，Silva R G，Morris B，et al. Surface charge-dependent toxicity of silver nanoparticles[J]. Environ. Sci. Technol.，2011，45（1）：283-287.

[48] Shao F C，Zhang H. Aggregation and dissolution kinetics of nanosilver in seawater[J]. Asian Journal of Chemistry，2013，25（5）：2886-2888.

[49] Lok R P，Paul T，Rygiewicz M G J. Preferential interaction of Na+over K+with carboxylate-functionalized silver nanoparticles[J]. Sci. Total. Environ.，2014，490（15）：11-18.

[50] Pokhrel L R，Scheuerman P R. Impacts of select organic ligands on the colloidal stability，dissolution dynamics，and toxicity of silver nanoparticles[J]. Environ. Sci. Technol.，2013，47（22）：12877-12885.

[51] Baalousha M，R?mer I，Tejamaya M，et al. Effect of monovalent and divalent cations ， anions and fulvic acid on aggregation of citrate-coated silver nanoparticles[J]. Sci. Total. Environ.，2014，454（14）：119-131.

[52] Santiago B，Eduardo M. Silver nanoparticle aggregation not triggered by an ionic strength mechanism[J]. J. Nanopart. Res.，2013，15（4）：1526-1533.