常桂英（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林吉林132101；2.吉林省高?！伴L白山動植物資源利用與保護(hù)”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132101）

響應(yīng)面法優(yōu)化榆耳多糖提取工藝的研究

常桂英1，2
（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林吉林132101；2.吉林省高校“長白山動植物資源利用與保護(hù)”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132101）

摘要：應(yīng)用水提法對榆耳子實(shí)體中的多糖進(jìn)行提取條件優(yōu)化，以提高多糖提取率。依據(jù)單因素和Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用響應(yīng)面分析方法對水提法提取榆耳多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。研究以榆耳多糖提取率為響應(yīng)值，提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)為試驗(yàn)因素。結(jié)果表明：水提法的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取溫度84.925℃、提取時(shí)間3.477 h、料液比1∶50（g/mL）、提取次數(shù)為4次。在最優(yōu)提取工藝參數(shù)下多糖的實(shí)際提取率為9.596%。其中影響榆耳多糖提取率的主次因素為：提取時(shí)間（B）＞提取溫度（A）＞料液比（C）＞提取次數(shù)（D）。

關(guān)鍵詞：榆耳；多糖；響應(yīng)面

榆耳（Gloeostereum incarnatum Imai），又稱榆蘑，是分布于我國東北部山區(qū)、日本北海及前蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)的一種稀有藥食兼用野生真菌[1]，具有提高免疫力，強(qiáng)身健體，抗氧化，止痢抑菌[2]的功效。榆耳多糖是榆耳子實(shí)體中的主要生物活性物質(zhì)，目前對其研究主要集中在多糖結(jié)構(gòu)和藥理作用方面[3]，如高炬等應(yīng)用層析分離的方法從榆耳發(fā)酵液中分離出新倍半萜榆耳三醇；王述聲等對榆耳多糖水溶性多糖GIA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其主要糖苷鍵為α型，有少量的β糖苷鍵，Gal和Glc為其主體結(jié)構(gòu)，但劉瑞君的研究卻表明榆耳多糖是以β糖苷鍵連接的；劉丹發(fā)現(xiàn)榆耳浸膏中有明顯抗菌作用的是醇溶小分子[4]。此外，榆耳多糖能夠抑制人體部分腫瘤細(xì)胞的生長，為其功效的研究提供了新的方向。

近幾年，我國東北、山東地區(qū)出現(xiàn)了人工栽培的榆耳，色澤好，品質(zhì)佳，其中吉林省為榆耳栽培的主要產(chǎn)區(qū)，占全國榆耳總產(chǎn)的70%～80%[5]，為大規(guī)模生產(chǎn)榆耳多糖提供了保障。但是，目前針對榆耳多糖提取工藝方面的研究甚少，限制了榆耳多糖工業(yè)化生產(chǎn)。響應(yīng)面法優(yōu)化菌類多糖的提取工藝被研究者廣泛關(guān)注，本研究將采用響應(yīng)面法對榆耳多糖的最佳提取工藝進(jìn)行研究，分析各試驗(yàn)因素及其間交互作用對榆耳多糖提取率的影響，并通過對擬合多元二次回歸方程分析獲取最佳工藝參數(shù)。以期為工業(yè)化生產(chǎn)的榆耳多糖在醫(yī)藥開發(fā)應(yīng)用方面提供工藝支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

榆耳子實(shí)體由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食用菌研究中心提供；乙醇、苯酚、硫酸等均天為天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑。

1.2設(shè)備

FA1004A電子天平：上海精天電子儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；KDC-1044低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：青浦滬西儀器廠；FW-177中草藥萬能粉碎機(jī)：上海華巖儀器設(shè)備；UV-759-CRT：上?？乒揽茖W(xué)儀器有限公司；DHR-924385-III：上海科苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.2mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于具塞試管中，加蒸餾水至2.0m L，再加入1.0m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%苯酚，搖勻后，添加5.0mL濃硫酸，搖勻后，室溫（25℃）放置20min后，以蒸餾水管為空白，在490 nm下測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線形回歸，獲得葡萄糖溶液濃度（C）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的回歸方程式：C=0.135A-0.046 6，R2=0.997 9標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的擬合性。

1.3.2榆耳多糖含量測定

榆耳子實(shí)體的預(yù)處理：將采后的榆耳子實(shí)體除雜、清洗后，在40℃低溫烘箱中烘至恒重。用中藥粉碎機(jī)將烘干子實(shí)體粉碎，過40目篩，然后用索氏提取器對其脫脂，干燥后備用。

榆耳多糖的提?。悍Q5.00 g榆耳粉末，用不同提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對榆耳多糖進(jìn)行提取和離心。將離心后的上清液進(jìn)行減壓濃縮。按體積比1∶4將濃縮液加入到無水乙醇中進(jìn)行醇析，離心、烘干得到榆耳粗多糖。

1.3.3單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面

根據(jù)榆耳多糖提取方法，取5.00 g榆耳粉末浸于中性蒸餾水中，考察試驗(yàn)中提取溫度（50、60、70、80、90℃），浸提時(shí)間（1、2、3、4、5 h），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）和浸提次數(shù)（1、2、3、4、5次）對榆耳子實(shí)體多糖提取率的影響，并對多糖提取率進(jìn)行計(jì)算，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以榆耳多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，提取溫度（A），提取時(shí)間（B），料液比（C）和提取次數(shù)（D）為試驗(yàn)因素，利用響應(yīng)面法在四因素三水平上對榆耳多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。采用Design Expert Version 9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1提取溫度對榆耳多糖提取率的影響

提取溫度對榆耳多糖提取率的影響見圖1。

圖1　提取溫度對榆耳多糖提取率的影響Fig.1　Effectofextraction tem perature on extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，榆耳多糖提取率逐漸增加；當(dāng)溫度超過80℃，榆耳多糖提取率反而下降。結(jié)果表明，浸提液溫度升高能增加榆耳多糖在水溶液中的溶解度，溫度在80℃左右達(dá)到最高提取率，但是溫度過高可能導(dǎo)致榆耳多糖的結(jié)構(gòu)被破壞，而且當(dāng)溫度高于80℃時(shí)可能會導(dǎo)致多糖的生物活性降低。

2.1.2提取時(shí)間對榆耳多糖提取率的影響

提取時(shí)間對榆耳多糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，榆耳多糖提取率逐漸增加；但提取時(shí)間達(dá)到3 h后，榆耳多糖的提取率開始下降。榆耳多糖隨著浸提時(shí)間的延長，其在水溶液中的溶解度會增加，浸提3 h達(dá)到飽和狀態(tài)，隨著時(shí)間的延長，持續(xù)的高溫可能會破壞多糖結(jié)構(gòu)，從而降低了多糖的溶解。另外，浸提時(shí)間越長，提取所耗能就越大，從而增加經(jīng)濟(jì)成本，因此榆耳多糖的浸提時(shí)間以3 h為宜。

2.1.3料液比對榆耳多糖提取率的影響

料液比對榆耳多糖提取率的影響見圖3。

圖2　提取時(shí)間對榆耳多糖提取率的影響Fig.2　Effectofextraction timeon extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

圖3　提取液料液比對榆耳多糖提取率的影響Fig.3　Effectofsolid to liquid ratio on extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由圖3可知，隨著料液比的增加，榆耳多糖提取率逐漸增加；當(dāng)料液比達(dá)到1∶40（g/mL）后，提高水溶液的比例會使榆耳多糖提取率下降，這可能是因?yàn)橛芏谋壤冃∈沟闷湓谌芙膺^程中速度緩慢。另外，如果試驗(yàn)過程中的料液比比例過大也增加了后期濃縮的難度，增加濃縮時(shí)間，所以料液比控制在1∶40（g/mL）左右為好。

2.1.4提取次數(shù)對榆耳多糖提取率的影響

圖4　提取次數(shù)對榆耳多糖提取率的影響Fig.4　Effectofextraction cycleson extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，榆耳多糖提取率逐漸增加；但提取3次后，榆耳多糖提取率增加緩慢并趨于平穩(wěn)，表明榆耳多糖已經(jīng)基本被提取完全。另外，隨著提取次數(shù)的增多所消耗的溶液體積增大，所需的能耗也有較大的提高，所以提取次數(shù)控制在3次為佳。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化榆耳多糖提取工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取溫度（A），提取時(shí)間（B），提取液中料液比（C）和提取次數(shù)（D）為試驗(yàn)的4個(gè)因素，并用Y代表多糖的提取率，設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)方案。因素水平及編碼見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1　榆耳多糖提取率響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table1　Coded valuewith its relationalactualvalueof design

表2　榆耳多糖提取率的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2　Box-Benhnken designmatrix and corresponding results ofexperiment

采用Design-Expert v9.0軟件對榆耳多糖提取率進(jìn)行多元模型擬合分析，得到榆耳多糖提取率Y與榆耳多糖提取溫度、提取時(shí)間、提取液的料液比和提取次數(shù)的多項(xiàng)二次回歸方程：

應(yīng)用軟件Design-Expert9.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

表3　二次相應(yīng)面模型方差分析Table3　ANOVA for responsesurface quadraticmodle

由表3的結(jié)果可以得出以下結(jié)論：該響應(yīng)面模型的F值為10.07，P＜0.000 1回歸性顯著，該模型的失擬項(xiàng)的F值為0.47，P=0.831 4＞0.05，表明該模型擬合性良好，由不確定因素所帶來的影響可以忽略。此模型的樣本決定系數(shù)R2=0.921 6；模型的樣本調(diào)整決定系數(shù)為AdjR2=0.830 0；該模型中的預(yù)測樣本決定系數(shù)為Pred R2=0.630 6。預(yù)測樣本決定系數(shù)與調(diào)整后的決定系數(shù)較一致，故該模型擬合度較好，用此模型可用于對水法提取榆耳多糖提取率的分析和預(yù)測。

由表3可知，該模型中一次項(xiàng)中B對該模型的影響達(dá)到顯著（P＜0.05）水平。二次項(xiàng)中B2和C2和D2對該模型的影響均達(dá)到極顯著（P＜0.01）水平，A2則達(dá)到了顯著（P＜0.05）水平，此外，該模型的交互項(xiàng)中AB、 AD、BD和CD均達(dá)到了極顯著（P＜0.01）水平，AC和BC達(dá)到了顯著（P＜0.05）水平。由此可知，試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，且影響根據(jù)多榆耳多糖提取率的因素的順序?yàn)椋禾崛r(shí)間（B）＞提取溫度（A）＞料液比（C）＞提取次數(shù)（D）。

2.3交互項(xiàng)作用對榆耳多糖提取率影響的分析

通過Design-expert軟件，多項(xiàng)二次回歸方程可得到響應(yīng)面圖，見圖5。

圖5　各因素交互作用對榆耳多糖提取率的響應(yīng)面圖Fig.5　3-Dm od legraphs for theeffects of interaction on the extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

響應(yīng)面圖可以反映試驗(yàn)中交互項(xiàng)的相互作用。模型中交互項(xiàng)AB、AD、BD和CD對模型的影響達(dá)到了極顯著（P＜0.01）水平（對應(yīng)為圖A、C、D、E），AC和BC達(dá)到了顯著（P＜0.05）水平（對應(yīng)為圖B、F），由圖可知，A-F圖具有類似的變化趨勢，在低編碼水平時(shí)榆耳多糖提取率均隨編碼值的變化先升高后降低，根據(jù)響應(yīng)面和等高線，在試驗(yàn)各條件所選取的范圍內(nèi)，存在極值點(diǎn)，在響應(yīng)面圖中表現(xiàn)為最高值點(diǎn)，在等高圖中表現(xiàn)為橢圓中心點(diǎn)。

由A圖知，在提取溫度相對較低的情況下提取時(shí)間延長會增加多糖分解的風(fēng)險(xiǎn)。而提取時(shí)間固定，提高提取溫度可以在一定程度上增加多糖的提取率，延長時(shí)間可以使多糖盡可能的浸出，以增加多糖的得率。由圖B知，在溫度編碼水平一致的情況下，料液比的低水平到高水平的多糖提取率變化不顯著，在高水平時(shí)變化平緩。由圖C知，提取次數(shù)的增加在一定程度上增加了提取的時(shí)間，降低提取效率，增加了能耗，在持續(xù)的提取過程中多糖結(jié)構(gòu)會發(fā)生降解。由圖D知，提取時(shí)間在低編碼水平時(shí)，隨提取次數(shù)的增加提取率降低，而提取時(shí)間在高編碼水平時(shí)恰好相反。因此短時(shí)間提取不能充分溶解多糖；多次提取多糖卻加大了后期濃縮的難度。由圖E知，提取次數(shù)與料液比在較低編碼水平向較高編碼水平變化時(shí)提取率均是先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。在該二因素都趨于高編碼水平范圍內(nèi)時(shí)，多糖的提取率較高。若繼續(xù)增加提取次數(shù)或料液比則可能會使多糖的結(jié)構(gòu)降解導(dǎo)致提取率降低。由圖F知，該圖表現(xiàn)出的趨勢與E相似，當(dāng)提取時(shí)間與料液比都在低編碼水平時(shí)，多糖提取率低，隨著該二因素的增加，多糖溶解率增加，達(dá)到一定程度后趨于平衡，并因可能增加多糖分解的幾率以導(dǎo)致其下降。

分析可知，榆耳多糖的最優(yōu)得率為9.596%，而獲得該提取率時(shí)的條件如下：提取溫度84.925℃，提取時(shí)間3.477h，提取料液比1∶49.32（g/mL），提取次數(shù)3.821次（選取4次）。而預(yù)測最佳榆耳多糖的率為（9.753± 0.209）%，與最優(yōu)得率的差值小于0.4%，能夠很好的預(yù)測水法提取榆耳多糖的得率。

3　結(jié)論

依據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果可知，水提法中各因素優(yōu)化后可以顯著的提高榆耳多糖的提取率。響應(yīng)面法可以較全面的評估、優(yōu)化榆耳多糖的提取工藝，在節(jié)約能量，材料和縮短時(shí)間的前提下，本研究獲得的水法提取榆耳多糖的最佳工藝條件為：提取溫度85℃、提取時(shí)間3.5 h、料液比1∶50（g/mL）、提取次數(shù)4次，此時(shí)多糖提取率為9.596%。經(jīng)Box-Behnen Design的回歸擬合分析，得到榆耳多糖提取率與提取溫度（A），提取時(shí)間（B），料液比（C）和提取次數(shù)（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程Y=8.68-0.064A+0.170B+ 0.035C+0.032 D-0.550 AB+0.250AC-0.340AD+ 0.310BC+0.450BD-0.460CD-0.240A2-0.540 B2-0.310C2-0.360D2。

在榆耳大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，本研究為提取菌類多糖提供了新的材料來源，并且為榆耳多糖的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論參數(shù)，具有比較廣泛的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.005

收稿日期：2015-05-19

基金項(xiàng)目：2013年吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院《微生物學(xué)》重點(diǎn)學(xué)科“榆耳多糖提取工藝優(yōu)化研究”（2013－007）

作者簡介：常桂英（1965—），女（漢），教授，碩士，研究方向：生物化學(xué)。

Optim ization of the Extraction Process of Polysaccharide from Gloeostereum incarnatum by Response Surface Methodology

CHANGGui-ying1，2
（1.Departmentof Bioengineering，Collegeof Jilin Agriculture Science and Technology，Jilin 132101，Jilin，China；2.Key Laboratory of the Animaland PlantResourcesof ChangbaiMountain Conservation and Utilization，College of Jilin Province，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：The objective of this research was to optimize the extraction conditions of Gloeostereum incarnatum by using water in order to enhance the extraction rate of polysaccharide.Based on single factor and Box-Behnken experiment design，response surfacemethodology was used to optimize the conditions of extraction technique of polysaccharide from Gloeostereum incarnatum.In order to improve the extraction ratio，extraction temperature，extraction time，solid to liquid ratio and extraction cycle were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimal hydrolysis conditions of the polysaccharide ratio were as followed：extraction temperaturewas84.925℃；extraction timewas3.477 h；solid to liquid ratiowas1∶50（g/mL）and the extraction cyclewas 4.Under the optimal conditions the theoretical extraction ratio of polysaccharide was 9.596%.Among the series of conditions，the importance effects on extraction ratio were ranged as extraction time，extraction temperature，solid to liquid ratio and extraction cycles.

Keywords：Gloeostereum incarnatum；polysaccharide；responsesurfacemethodology